[发明专利]一种筛选蛋白酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选蛋白酶抑制剂的方法。 

背景技术

癌症是严重影响人类生活质量和生存的重大疾病之一，对于癌细胞浸润、转移至其他组织与器官，人类尚无可行方法加以阻止。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是参与癌症转移的主要酶之一，可降解癌细胞周围的组织，使癌细胞扩散至较大范围或进入血液循环转移至其他器官。抑制基质金属蛋白酶的活性可有效地控制癌细胞的转移，所以从已知或新合成的化合物中筛选出能抑制基质金属蛋白酶活性的抑制剂是当前抗癌药物研究的热点，为此必须建立有效、可行、经济的基质金属蛋白酶抑制剂评估体系。 

目前高通量筛选体系主要有荧光法和分光光度法。前者利用两个荧光基团的FRET（荧光共振能量转移）变化来获得抑制剂能力大小，其反应底物是人工合成的肽片段，并在该底物两端连接上两个荧光染料，当所用底物完整时，由于第一个荧光染料被激发时所发出的荧光能量被比邻的第二个荧光染料所吸收，从而使第一个荧光基团的荧光淬灭。当有基质金属蛋白酶存在时，底物被降解，使得两个荧光基团分离，恢复第一个荧光基团的荧光。因而荧光的变化反应了基质金属蛋白酶活力的大小：有抑制剂时，荧光变化缓慢；无抑制剂时，变化迅速。从而根据荧光变化获得抑制剂的半数抑制浓度。分光光度法也是利用人工合成的含有巯基的肽片段（寡肽）作为底物，当基质金属蛋白酶水解该底物后，释放出带有巯基的片段。利用巯基的Ellman′s Reagent反应形成黄色化合物，黄色的深浅反应了基质金属蛋白酶被抑制的程度。 

虽然荧光法（或分光光度法）已用于基质金属蛋白酶抑制剂的筛选， 具有较高的灵敏性和大通量筛选，但仍有某些缺点：1）由于过灵敏，人工假相常见于实验中，要设计合理的对照组；2）若抑制剂有荧光或能淬灭荧光，不能使用；3）需要人工合成底物，较高的花费；4）需要特殊的仪器；5）荧光较易被其他杂质或反应缓冲液组分所淬灭或增强，造成假象。 

茚三酮（ninhydrin）是一个有机化合物，在生命科学研究、生物工程、食品工业及犯罪现场指纹分析中广泛使用，它与氨基酸可形成紫色化合物而用于氨基酸含量测定。氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。此化合物最大吸收峰在570nm波长处。同时，茚三酮亦用于蛋白含量测定，但均为将蛋白完全水解成氨基酸（24小时消化水解），再与茚三酮反应，前期反应费时费力，增大了反应的成本，不利于大通量的蛋白与茚三酮反应。 

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种筛选蛋白酶抑制剂的方法。 

本发明利用蛋白酶水解其底物—蛋白质时所形成的氨基酸或肽片段与茚三酮反应，生成紫色化合物进行比色（见图1~4），以吸光度值（OD）代表颜色的深浅，进而反映蛋白酶水解时被抑制的程度，从而获得抑制剂的半数抑制浓度(IC₅₀或LD₅₀）。 

本发明提供的一种蛋白酶抑制剂筛选方法，包括步骤： 

（1）将待测物添加到蛋白酶溶液中混匀，反应；同时设未添加待测物的蛋白酶溶液为空白对照； 

（2）含待测物的蛋白酶溶液和空白对照中分别加入底物蛋白溶液进行反应，得到反应液； 

（3）反应液中加入反应终止液； 

（4）再加入茚三酮反应液进行反应； 

（5）加入双蒸水，根据吸光度值OD_570nm判断结果，若含待测物溶液 的吸光度低于空白对照，则待测样品为阳性。 

所述蛋白酶为水解蛋白酶。 

优选地，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶或胰酶。 

其中，步骤（1）将待测物添加到蛋白酶溶液中混匀平衡时间≥5min。 

其中，步骤（1）中蛋白酶溶液制备方法为：将浓度为1mg/ml的蛋白酶水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:16~30混合得到蛋白酶溶液；步骤（2）中底物蛋白溶液制备方法为：15-30mg/ml的底物蛋白水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:5~10混合得到底物蛋白溶液。