[发明专利]一种检测口蹄疫病毒的RT-HDA试剂盒及引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测口蹄疫病毒的RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的急性热性高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽，患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水泡，破溃形成烂斑。人和非偶蹄动物也可感染本病，但症状较轻。由于猪、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成全球大规模流行，所以世界动物卫生组织（OIE）和联合国粮农组织（FAO）将该病列为A类动物传染病。在我国，口蹄疫被列为一类动物传染病。历史上口蹄疫的暴发给世界畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重的影响了社会政治、经济的稳定发展，是名副其实的“世界政治经济病”。口蹄疫在世界的分布也很广，可在国际间相互传播形成世界范围内的大流行。至今几乎世界上所有的国家或地区历史上都曾经发生过口蹄疫。在17～19世纪，欧洲大陆曾多次发生和广泛流行本病。到20世纪80年代，大洋洲、北美洲已无口蹄疫疫情，欧洲国家的疫情也大大减少，而亚洲、非洲和南美洲各国则是口蹄疫的重疫区。近年来，口蹄疫在世界上主要流行于亚洲，其次是非洲、南美洲和欧洲。口蹄疫在我国流行历史由来已久，其特点是在一定地区一定时间接连不断发生。而且我国毗邻的很多周边国家和地区多为口蹄疫流行疫区，疫病呈周期性暴发，且反复不断。这些因素对我国造成严重威胁，发生口蹄疫大流行的可能性非常大。历年来我国政府和地方各防疫机构都非常关注口蹄疫的疫情动态，并高度重视口蹄疫的防制工作。随着加入WTO，我国从其他国家进口牛肉和猪肉等产品的批次和数量都急剧上升，所有这些都要求我们能够提高检验检疫技术水平，力促外贸工作的顺利进行并保证人畜及生产的安全。

口蹄疫病毒具有型多易变的特点，目前有7个血清主型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亚洲Ⅰ型。每一主型又分若干亚型，迄今为止已发现的亚型有65个，且仍可能在不同的地区出现新的变异株和新的亚型。我国口蹄疫的病毒型主要为O、A型和亚洲Ⅰ型。动物感染一种血清型的病毒后，不产生对其他型的免疫力，但同型的亚型之间有部分的交叉反应。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术（包括细胞培养和动物接种两种方法）、血清学检测技术（包括病毒中和试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显微镜技术等）和分子生物学技术（包括聚合酶链式反应、核酸探针、核酸序列分析、电聚焦寡核苷酸指纹图谱法、基因芯片技术等）。实际检测中，对肉类食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性，但传统的诊断方法不能满足这一要求。常规的PCR技术虽然提高了检测的灵敏度和特异性，但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。近几年发展起来的实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已逐渐成为病原体检测的重要方法。但是，荧光PCR仪造价不菲，仪器和试剂检测成本过高使得这一检测技术始终局限于条件比较好的实验室中，难以在基层推广应用。

近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器设备要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术（Helicase-Dependent Isothermal Amplification，HDA）是2004年BioHelix的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。HDA技术与其他基因扩增技术比较，具有如下优势：

1.与PCR技术相比，HDA技术模仿自然界DNA合成方式，凭借DNA解旋酶解开双链并完成扩增，而传统PCR是通过变性-退火-延伸过程的多次循环实现。由于原理的不同，使得HDA的优点尤其突出：①HDA反应在同一温度下进行，因而不需要昂贵的PCR仪，有利于在基层实验室推广应用。②由于只用一种温度扩增使得HDA反应时间明显缩短，仅需1h左右。③HDA技术采用去除了5’-3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，该酶兼具耐高温性、高效扩增反应性、极好的条带均一性及高准确性等特点，不易引起非特异性扩增，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。