[发明专利]一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及建立鸡的永生化前脂肪细胞的方法。

背景技术

脂肪不仅是能量储藏组织，而且是机体生长发育过程中重要的内分泌器官。脂肪的功能发生紊乱可导致肥胖症，并可引发代谢综合症以及多种复杂疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常、高血压和恶性肿瘤等。由于肥胖症及其相关疾病在全球发病率逐年上升，脂肪细胞分化和脂肪细胞功能研究成为了当今生命科学研究的热点。

在农业生产领域，腹脂过度蓄积是肉鸡业生产的一个难题。为了解决实际生产中肉鸡腹脂过度蓄积的问题，培育优质低脂肉鸡，我们需要有针对性地开展肉鸡腹部脂肪细胞分化的研究。目前，鸡脂肪细胞分化研究仍然依赖于体外培养的原代鸡前脂肪细胞，而原代培养的细胞本身存在不能无限传代、异质性(混合了巨噬细胞、间皮细胞或者其它一些细胞类型)、不同来源的细胞存在遗传背景差异等难以克服的缺点和不足，从而导致了研究难以获得稳定可靠的结果。脂肪细胞分化的理想研究模型是永生化的前脂肪细胞。与体外培养的原代细胞相比，永生化的前脂肪细胞既具有无限增殖能力，又具有正常前脂肪细胞的特征，它能提供大量稳定均一、性状一致的细胞来源，排除由于不同发育阶段、不同生理条件以及不同细胞群体间的影响，保证了研究的重复性和可比性。目前，人类已通过多种方法建立了人(包括白色脂肪和棕色脂肪)、鼠、牛和猪等物种的永生化前脂肪细胞系，而鸡的永生化前脂肪细胞至今尚未建立。

建立永生化细胞系主要有自发突变、射线照射、化学诱变、病毒感染、病毒癌基因转导和端粒酶活性重建等方法，其中端粒酶活性重建被认为是目前建立永生化细胞的首选方法。人的端粒酶基因hTERT已被广泛用于人及多种哺乳动物细胞的永生化。截至目前，国内、外尚无应用hTERT建立鸡永生化前脂肪细胞的研究报道，更无利用鸡的端粒酶逆转录酶(chTERT)和端粒酶RNA(chTR)建立鸡永生化前脂肪细胞的报道。

发明内容

本发明是要解决原代鸡前脂肪细胞不能无限传代、异质性、不同来源的细胞存在遗传背景差异等导致研究难以获得稳定可靠的结果的问题而提供一种建立永生化的鸡前脂肪细胞的方法。

本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤进行：

一、克隆chTERT的全长编码区序列：

首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT-T1、chTERT-T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-T1和chTERT-T2两个片段拼接起来，得到chTERT-T1T2，将chTERT-T1T2连接至pMD18-TSimple载体，将chTERT-T3连接至pMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOP10感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到pMD18TS-T1T2与pMD18T-T3，然后对pMD18TS-T1T2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T-T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段，将回收得到的chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段连接，得到pMD18T-chTERT；

二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR：

利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOP10感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR，然后对pMD18T-chTR质粒进行BglII-Cla I双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；

三、构建逆转录病毒表达载体：