[发明专利]一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法

权利要求书

1.一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，其特征是：以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在55-100%范围内。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在62.3-100%范围内。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在71.3-100%范围内。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征是：采用通入富氧空气或氧气的方式维持发酵液中的高溶解氧浓度；发酵过程发酵周期为12-20 h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：发酵过程中保持氧气或富氧空气的通气比为0.2-1.5 L/L·min；所述富氧空气中氧气的体积分数为30-99%。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是：所述富氧空气中氧气的体积分数为45-75%。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所用氧化葡糖酸杆菌为氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）TL-1045 CGMCC NO.6188；所用的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌ATCC 14581。

9.根据权利要求1、2、3、4或8所述的方法，其特征是：混菌发酵时，按照5-20%的接种量将菌种接种到发酵培养基中，在温度27-32℃、转速80-250 rpm条件下发酵12-20h，发酵过程中流加碱性物质溶液控制pH 6.7-7.3，当发酵液中L-山梨糖下降到5-15 g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25 g/L；发酵培养基组成为：山梨糖20-30 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.3。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征是：混菌发酵前需要制备种子液，以得到接种量所需数量的菌种，种子液制备包括以下步骤：

（1）菌种的活化：将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，然后27-32℃下培养18-24 h，得活化的菌种液；

（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10^-5-10^-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27-32℃下培养4-6天；

（3）混菌的培养：用接种环将步骤（2）中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤（2）中平板上选择巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27-32℃培养3-5天；

（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32℃、80-250 rpm的条件下培养18-24 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶；

（5）种子液的扩大培养：将步骤（4）得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在80-250 rpm、富氧空气或氧气通气比0.2-1.5 L/L·min、27-32℃条件下培养10-15 h，所述富氧空气的氧气体积分数为30-99%；

种子液制备过程中，所用培养基组成如下：

步骤（1）中活化培养基的组成为：山梨糖5-15 g/L，葡萄糖 2-5 g/L，酵母膏3-8 g/L，玉米浆3-10 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.2；

步骤（2）中平板培养基组成为：山梨糖5-20 g/L，胰蛋白胨1-5 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，玉米浆2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏0.5-2.0 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5 g/L，硫酸镁0.1-0.3 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-7.2；

步骤（3）中茄瓶培养基组成为：山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁1-3 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-7.2；

步骤（4）中种子培养基的组成为：山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.2；

步骤（5）中扩大培养基组成为：山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0.05-0.2 g/L，pH 6.7-7.2。