[发明专利]一种提高棘孢小单孢菌孢子萌发率的方法

说明书

技术领域

    本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高棘孢小单孢菌孢子萌发率的方法。

背景技术

    异帕米星(Isepamicin)作为新一代半合成的氨基糖苷类抗生素，其抗菌谱类似庆大霉素，对大肠埃希菌、枸橼酸杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌、沙雷杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌等有很强的抗菌作用。其除耳、肾毒性低之外，还对细菌产生的多数氨基糖苷钝化酶稳定，有良好的抗生素后效应，因此许多耐庆大霉素及部分耐阿米卡星的菌株对其仍呈敏感，特别是对硫酸庆大霉素耐药菌株引起的败血症、外伤、烫伤、手术创伤、二次感染、慢性支气管炎、支气管扩张感染、肺炎、肾盂肾炎、膀胱炎和腹膜炎等感染症都有效，因此其具有良好的发展前景。

    作为半合成抗生素的异帕米星，其是在庆大霉素B的1位氨基上连接上异丝氨酸衍生而成的。而庆大霉素B作为合成异帕米星的重要的前体物质，是由棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）发酵产生的。庆大霉素B的生产方式是将棘孢小单孢菌经孢子制备、摇瓶菌丝培养后接入种子罐，种子经过一级、二级、三级扩级培养后接入发酵罐。孢子制备是发酵工业生产中不可缺少的一个环节，孢子质量的好坏将直接影响到发酵生产的成功与否。孢子制备一般采用琼脂斜面培养基或一般固体培养基经接种后进行培养而得。由于小单孢菌的孢子属于低级类型的侧生孢子，其存在着厚内层细胞壁，这些因素造成了小单孢菌的孢子有80～90%是组成型休眠孢子，只有10～20%的孢子可以萌发。小单孢菌的低萌发率的特点，促使我们在发酵工艺上必须加大接种量和增加发酵级数，使工艺复杂、设备利用率降低、成本升高。

发明内容

    本发明的目的在于提供一种提高棘孢小单孢菌孢子萌发率的方法。

    为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

(1)     孢子萌发培养基的制备：取黄豆饼粉2-4%和玉米粉1.5-3%，加水定容，用6N HCl调pH2.0-3.0，煮沸并维持0.5-1.5小时，过程中补加蒸发掉的水分，冷却后回调pH6.0-7.0，过滤出浸汁备用；

(2)     在上述浸汁中加入可溶性淀粉1-2%，葡萄糖0.05-0.1%，硝酸钾0.05-0.1%，蛋白胨0.05-0.1%，胰蛋白胨0.05-0.1%，氯化钴0.0001-0.0003%，磷酸二氢钾0.005-0.01%，磷酸氢二钾0.01-0.03%，调pH7.2～7.5，制成孢子萌发培养基；

(1)     棘孢小单孢菌经斜面活化后，加孢子萌发培养基至斜面刮取孢子，得到孢子悬液，经过50-65℃水浴5-20分钟，然后迅速冷却，置于35-37℃摇床上1-4小时，摇床转速200-240rpm。

其中步骤（1）所述冷却后回调pH6.0-7.0采用质量比为30%NaOH溶液调节pH。

步骤（2）所述调pH7.2～7.5采用质量比为30%NaOH溶液调节pH。

本发明操作简单易行，关键技术在于孢子萌发培养基的制备、水浴热激活、孢子萌发，使棘孢小单孢菌的孢子萌发率由10-20%提高到30-50%，同时提高了孢子萌发和菌丝生长的同步性；本发明降低了成本，简化了工艺，使原来的四级发酵改进为三级发酵，提高了设备的利用率，使生产效率得到了很大的提高，增加了发酵过程的可预测性。

具体实施方式

实施例1：

1.        孢子萌发培养基的制备：黄豆饼粉2g，玉米粉3g，定容至100ml，用6N HCl调pH3.0，煮沸维持1小时，过程中补加蒸发掉的水分，冷却后用30%NaOH溶液回调pH6.0，过滤出浸汁备用；

2.        在上述浸出汁中加入可溶性淀粉1g，葡萄糖0.1g，硝酸钾0.05g，蛋白胨0.05g，胰蛋白胨0.1g，氯化钴200ug，磷酸二氢钾0.005g，磷酸氢二钾0.03g，30%NaOH溶液调节pH7.5，制成孢子萌发培养基；

3.        棘孢小单孢菌经斜面活化后，加15ml孢子萌发培养基至斜面刮取孢子制备孢子悬液，置于55℃水浴中热激活10分钟，然后迅速冷却，置于摇床上，温度35℃，摇床转速220rpm，培养2小时。