[发明专利]一种新型对虾多价载体疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因生物工程技术领域，涉及一种新型对虾白斑综合症病毒（WSSV）和弧菌病多价载体疫苗及其应用，具体地说是用于防治对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗及其应用。 

背景技术

对虾是主要在亚洲和拉丁美洲特别为出口目的生产的高价值水产品，目前我国主要的养殖品种为南美白对虾、斑节对虾和中国对虾。然而在过去的10多年里，对虾养殖生产中出现了相当严重的问题，其中白斑综合症病毒（White spot syndrome virus， WSSV）、桃拉病毒（Taura Syndrome Virus， TSV）和弧菌为重要病害元凶。对虾白斑综合症（white spot syndrome，WSS）是由对虾白斑综合征病毒（WSSV）引起的以感染对虾甲壳内侧出现直径为0.5～2 mm大小的白色斑点为主要特征的暴发性传染病。该病感染率和死亡率都极高，给养虾业造成了巨大的经济损失。到目前为止，在世界大部分对虾养殖区都爆发了白斑综合症，该病已成为全球对虾养殖业面临的最严重的挑战之一。除病毒病之外，弧菌病（Vibriosis）也是影响对虾养殖业最为常见、危害较重的一类疾病，它多发于6-9月间，在虾苗孵育阶段临床症状主要表现为发光，肠道破坏，病害爆发时可一夜间导致100％死亡率。白斑综合症和弧菌病已成为我国和全球对虾养殖业健康可持续发展的严重制约因素。 

白斑综合症病毒（WSSV）是属于Nimaviridae科Whispovirus属的代表种，是一种无包涵体、有囊膜的杆状病毒（van Hulten，et al.2001.Virology.286（1）:1-22）。它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可以侵染淡水及海洋生态中的多种蟹类、克氏鳌虾类、端足类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖造成严重的经济损失。因此世界范围内针对对虾白斑综合症病毒的防治技术开发受到广泛关注。 

近年的研究表明，白斑综合症病毒（WSSV）的重组囊膜蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。WSSV的主要结构白蛋有VP28、VP19、VP24、VP26、VP15等。VP19和VP28是主要的囊膜蛋白。VP19在囊膜蛋白的成分中所占比例仅次于VP28，国内外的研究将其作为设计免疫预防性药物的靶位点（Van Hulten M.C. et al. 2001. Virology. 286: 7-22）。目前，VP19基因已在原核或真核生物表达系统内表达，并且发现表达产物具有显著的抗病毒保护效应，保护效应次于VP28囊膜蛋白。VP281是WSSV的次要结构蛋白，由ORF1050编码，VP281中存在一细胞黏附序列 （RGD三肽序列），提示此囊膜蛋白可能在介导WSSV感染时发挥重要作用（Huang C H，et al.2002. Journal of General Virology 83: 2385-2392）。 

目前，国内外在研究WSSV疫苗上取得了很大的进展。已研发的包括有核酸类疫苗（Rout N， et al. 2007.Vaccine. 25:2778-2786； Rajeshkumar S， et al. 2009. 26（3）:429-437等）和重组疫苗（Witteveldt J， et al. 2004b. J Virol.78:2057-2061； Witteveldt J， et al. 2004a. Fish Shellfish Immunol.16:571-579； Mavichak R. et al. 2010. J Fish Dis. 33:69-74等）。Witteveldt J等发现VP28的亚单位疫苗对对虾免受WSSV的感染起到重要的保护作用，其免疫保护率达到70%。宁德刚等人（D. Ning， et al. 2011 Journal of Applied Microbiology 111:1327-1336）通过枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白展示系统将VP28蛋白展示到枯草芽孢杆菌的表面，通过口服的方式免疫克氏鳌虾，21天的免疫保护率为30%。2011年美国Harris等人证明在注射的条件下VP19的免疫保护率要优于VP28（J.Dustion Loy，DVM global aquaculture advocate May/June 2011）。2007年Namita Rout等人（Namita Rout，et al.2007.Vaccine.25:2778-2786）制备的VP281的DNA疫苗使对虾免受病毒感染的保护作用达到了50天。基于上述前人的研究结果，本发明采用的WSSV的抗原蛋白是VP281和VP19。