[发明专利]一种同时检测醋醅中四种功能微生物的多重PCR技术

权利要求书

1.一种用于醋醅中四种功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于多重PCR技术按照以下步骤进行：

（1）醋醅微生物群落总基因组DNA的提取：称正常发酵过程的醋醅2-5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化步骤等提取总基因组DNA；

（2）合成细菌16S rDNA V₃区引物P1，P2，并以醋醅群落微生物总DNA为模板进行PCR扩增，得到细菌16S rDNA V₃区的扩增片段；

（3）利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)对细菌16S rDNA V₃区扩增片段进行分析，其电泳条件为：8%聚丙烯酰胺凝胶，100%变性剂浓度为7M尿素、40%甲酰胺，采用30%~50%变性梯度，上样量为200 ng，缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳3.5-4 h，SYBRGreen Ⅰ染色，每15 min 染色一次，共染3次；

（4）优势微生物的序列测定：选择DGGE凝胶上10-20个最显著的条带，割胶回收进行序列分析，在NCBI中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属；

（5）功能微生物的筛选：以正常发酵的醋醅为筛选对象，采用肉汤、GYC、MRS 3种不同的培养基对不同功能微生物进行分离，选择生长较快、菌落形态不同、且GYC平板上有透明圈的60-80个菌落，纯化后保存；

（6）功能微生物的确定：对上述获得的纯培养微生物进行酶切分型，将分型结果不同的菌株进行16S rDNA 测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择4株优势微生物用于多重PCR技术；

（7）针对上述4株功能微生物菌株设计特异性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢杆菌、一株醋酸菌和两株乳酸菌；

（8）对4株功能微生物的多重PCR条件进行组合优化：包括反应体系的确定，反应条件的优化，最终使得4种微生物在同一PCR条件下同时被检测出来；

（9）利用上述确定的多重PCR条件，对发酵过程中醋醅样品中的功能微生物进行快速检测。

2.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，所述步骤（2）中的引物序列如下所示：

P1：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’

P2：5’-[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。

3.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，所述步骤（5）中培养基如下所述：

肉汤培养基（g/100 mL）：

葡萄糖2.5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉0.5，氯化钠0.3，琼脂2.0，pH 7.0-7.2，用前加入5 mL无水乙醇；

MRS培养基（g/100 mL）：

胰蛋白胨 1，牛肉膏1，酵母粉 0.5， 磷酸氢二钾 0.2，乙酸钠 0.5，柠檬酸三铵 0.2，葡萄糖 2，七水硫酸镁 0.058，一水硫酸锰 0.019，吐温80  0.1mL，琼脂1.5-2.0，pH 6.2-6.5，用前加入5 mL无水乙醇；

GYC培养基（g/100 mL）：

葡萄糖 1，无水乙醇 3，酵母粉 1，碳酸钙 1.5，琼脂1.5-2.0。

4.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤（7）中所述的特异性引物，其序列是如下表所示。

5.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤（8）中所述的多重PCR的最优反应体系采用50μL体系，具体如下：1×Ex PCR buffer(含dNTP) 10 μL；Mg²⁺（25 mM）4 μL；Ex Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL；正向引物2 μL；反向引物2 μL；Template DNA10 ng；ddH2O至50 μL。

6.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤（8）中所述的多重PCR的最优反应条件如下：预变性94℃5 min；变性94℃30s，退火64-51℃45s，延伸72℃1min，共26个循环，其中退火温度每个循环降低0.5℃；变性94℃30s，退火51℃45s，延伸72℃1min，共15个循环；终延伸72℃10min。