[发明专利]多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞分离纯化技术领域，涉及一种成体干细胞群的分离纯化方法。

背景技术

NG2（Nerve/Glial 2）阳性细胞是一群主要分布在中枢神经系统（Central Nerve System, CNS）的细胞，被命名为少突胶质细胞祖先细胞（Oligodendrocyte Procursor Cells, OPCs）。传统概念定义，NG2阳性细胞是CNS所特有的具有修复功能的干细胞群。但目前NG2阳性细胞作为干细胞在发育期CNS中的研究较多，而由于缺少从成体CNS中分离纯化NG2阳性细胞的实用方法，关于NG2阳性细胞在成体CNS中是否同样具有干细胞潜能至今尚不清楚。此外，近年研究发现，CNS以外的其它器官也有NG2表达，例如血管窦周细胞（Pericytes, PCs），但目前研究证据还不足以支持PCs与NG2阳性细胞的同源性。最近Berry研究团队也报道，成年小鼠心脏主动脉有NG2表达，且表达NG2的细胞在特定诱导环境下可以分化为少突胶质细胞，提示NG2阳性细胞可能并非CNS所特有的干细胞群。

当今从哺乳类个体成体的各组织器官中寻找具相似生物学特性和修复特性的单一群体细胞是干细胞研究的热点，而上述细胞群的分离纯化恰是其中的难点。该难点的攻破将为损伤器官的干细胞治疗开辟一条新的途径。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从成体多器官中分离纯化具有相似生物学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群的有效方法，为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定基础，并为干细胞临床治疗和再生医学领域提供新型干细胞群。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1．多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，包括以下步骤：

a．分离成年哺乳类动物的中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织，去除被膜，用含有抗生素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；

b．将步骤a破碎后的组织用细胞消化液消化，再用含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液充分吹打分散细胞，用细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，离心，弃上清；

c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30% Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30% Percoll分离液等体积的70% Percoll分离液的液面上，1500~3000rpm离心15~30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；所述30%Percoll分离液是将percoll分离液与含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液按体积比为3:7混合制得；所述70%Percoll分离液是将percoll分离液与0.01mol/L PBS按体积比为7:3混合制得；

d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每隔3~7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔3~4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；所述新鲜培养液为新制的含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液，

e．将步骤e所得原代NG2阳性干细胞群用细胞消化液消化后进行传代培养。

优选的，步骤a中所述含有抗生素的MEM培养液是含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养液；步骤b和e中所述细胞消化液是胰酶/EDTA消化液，由质量分数为0.25%的胰酶溶液与质量分数为 0.02%的EDTA溶液按体积比为1: 1混合而成；步骤b中所述含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为0.04%的脱氧核糖核酸酶I、质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液；步骤c和d中所述含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液。