[发明专利]鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于芽孢杆菌属，杆状，染色均匀；芽孢0.8×1.5~1.8μm；菌落源或不规则形，表面色暗；可起皱，形成奶油色或褐色；在培养液中可形成完整的膜，轻度浑浊。

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）属于片球菌书，球状，四联活成片状排列；细胞直径约1μm；在MRS培养基上生长良好，菌落生长在表面的呈规则的圆形，白色扁平；在液体培养基中浑浊，菌体沉淀到培养基底部，呈白色。

戊糖片球菌在厌氧或兼性厌氧条件下生长并产生乳酸等代谢产物，对酸有较强的耐受范围（pH4.5-8），且产生片球菌素（pediocin）以抑制有害肠道细菌的生长；但该菌对温度的耐受范围相对较低，高于50℃时细菌失活；健康鸡体温为41.5℃，因此该菌只能作为微生物添加剂添加入饲料中，而不能经过高温，制粒等加工过程。而枯草芽孢杆菌属于不致病的需氧芽孢杆菌，其芽孢形式的活菌能够耐酸、耐高温，稳定性较好。

研究发现，即使是物种相同不同株系的益生菌对肠道不同区域的特异性粘附有差，发挥的特异免疫作用也有差。微生物饲料添加剂具有特异的宿主范围，超出宿主范围对添加剂的作用效果不大。同时，在动物个体发育各个阶段，将乳酸菌和芽孢杆菌配合使用，不仅能有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，同时产生各种消化酶（如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）的活性，使对饲料的利用效率高于单一菌株。

常见禽用益生菌使用方式主要是饮水或饲料。但如果用饮水方式添加时，容易受到空气、紫外线、自来水中消毒剂和金属离子等作用而降低活性甚至失活，且该种方式受到地域和气候的影响，对使用量无法控制直接影响发挥的作用。因此，制成微生物粉状制剂直接饲喂动物，受外界环境的影响更易控制并降低，对饲喂量的确定更易被普通养殖户掌握，便于推广。

禽用饲料的主要原料成分主要包括玉米粉和豆粕；麦麸蛋白质含量很高，氨基酸组成可与整粒小麦相比，因此在禽用饲料中也占有一定比例；但其高纤维、低容重等特征限制其使用比例。通过微生物在固体发酵过程中提高对饲料原料中蛋白质的水解，形成更多可直接被动物肠道吸收利用的小肽（二、三肽），对家禽生长起到促进作用；同时，益生菌以活菌形式进入肠道后，改变肠道微生物区系，产生的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶活作用也促进了对饲料原料的水解和小肽的形成，提高氨基酸、矿物元素的吸收利用，从而提高动物生长或生产性能。因此，通过模拟人工胃肠道环境优选出的枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌以饲料原料为培养基的固体发酵条件的优化，并混合两微生物菌剂饲喂鸡群，提高动物个体生长性能的应用意义重大。

发明内容

本发明提供两株从鸡盲肠分离得到、并通过人工胃肠道环境耐受试验的枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌，并直接以饲料原料为培养基优化固体发酵技术，制备得到含优选鸡源枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌的微生物制剂及其混合菌剂的应用方法。

鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂的制备方法，菌种选择：选用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株已于2012年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC  NO.6565,分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株已于2012年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.6566,分类命名：戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus；；两个菌株经过发酵，获得发酵产物即为固体发酵菌剂。

所述的发酵方法为：

（1)种子培养：将所述的两个菌株经斜面活化后，分别在无菌条件下用接种环接1～2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养48h，得一级种子液；以接种环接2～3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养36小时，得二级种子液；