[发明专利]靶向沉默MyoⅩ的序列制备及其载体的构建

说明书

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及特异性沉默靶标蛋Myo Ⅹ的序列设计合成及其表达载体构建。

背景技术     

肌球蛋白X（Myosin X, Myo Ⅹ）是1994年于牛蛙的内耳中首次发现的，属于非传统型肌球蛋白家族，是细胞内重要的分子马达，在神经系统发育中调节神经突起的生长。Myo Ⅹ分子由头部、颈部和尾部三部分组成。头部区是马达结构域，具有磷酸水解酶活性；颈部区具有三个IQ结构域，是Myo Ⅹ与类钙调蛋白（CLP）相互作用的部位；尾部区包括一个能使两分子Myo Ⅹ形成二聚体的铰链结构域、三个能切割钙蛋白酶的PEST结构域、三个能与PIP3结合的PH结构域、一个能与微管结合的MyTH4和一个能结合β整合素（β-integrin）的FERM结构域。

自发现以来，Myo Ⅹ 被广泛的研究，近年来的研究表明，Myo Ⅹ参与丝足的形成、延伸和稳定，对丝足内物质的运输起着非常重要的作用，在乳腺癌的发生发展过程中，Myo Ⅹ的高表达预示着肿瘤具有强的转移潜能，所以特异性的沉默Myo Ⅹ至关重要。

发明内容

本发明的目的是合成特定的能够靶向沉默Myo Ⅹ的特异碱基序列，为更加深入的研究Myo Ⅹ以及Myo Ⅹ在选择、制备治疗肿瘤药物中的作用提供了有效的手段。

本发明中所需要构建的主要是Myo Ⅹ的沉默表达载体。核心沉默表达载体构建分为两个大的步骤，首先是根据人源的Myo Ⅹ序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pEN-h-siRNA载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定。鉴定正确后，用pEN-h-siRNA-Myo Ⅹ和pDSL-hpGIP进行LR重组反应，这两个载体重组后形成核心的沉默表达载体，转化，挑取阳性克隆鉴定，阳性克隆酶切鉴定测序正确，进行沉默效率的检测。

本发明中设计合成了能够靶向人源Myo Ⅹ的19bp的目的片段，片段序列为  

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能够特异性沉默Myo Ⅹ的表达载体的构建包括以下步骤：

第一步，序列设计

    根据人源Myo Ⅹ基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别Myo Ⅹ的序列。

第二步，表达载体pEN_hH1-Myo Ⅹ的构建

    将表达载体pEN_hH1双酶切后, 利用回收试剂盒回收线性化载体。经连接、转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定。

第三步，LR重组构建Myo Ⅹ-shRNA

    质粒抽提试剂盒抽提pDSL_hpUGIP和pEN_hH1-Myo Ⅹ质粒，经重组、转化、提取等步骤获得重组的载体。酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定。

第四步，沉默靶蛋白效率的检测

    经转染细胞后提取蛋白，利用 western blot等试验手段检测沉默效率。

附图说明：

图1为特异性沉默靶蛋白Myo Ⅹ的序列的合成凝胶电泳图；

图2为pEN_hH1表达载体BamHⅠ和Xhol双酶切电泳图；

图3为pEN_hH1表达载体BamHⅠ和Xhol双酶切回收电泳图；

图4为LR重组构建Myo Ⅹ-shRNA测序结果；

图5为利用RT-PCR检测，转入Myo X-shRNA后Myo X表达量明显降低，GAPDH为内参；

图6为图5结果的统计图，对5次独立实验结果分析，沉默效率为51.5%，进行t检验p<0.01差异极显著；

图7 为Western blot免疫印迹分析，转入Myo Ⅹ siRNA沉默载体后Myo X表达量降低70%。

 

              本发明中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默Myo Ⅹ，同时也为构建Myo Ⅹ-shRNA提供关键的序列片段。Myo Ⅹ是一种非传统的肌球蛋白，经研究表明，Myo Ⅹ在肿瘤的形成和转移过程中发挥一定的作用，构建成功的载体，能够用来特异性的沉默Myo Ⅹ，沉默Myo Ⅹ能够降低肿瘤的转移潜能，所以能够为选择、制备治疗肿瘤药物提供了理论基础。

 

具体实施方式：

实施例一: 特异性沉默靶标蛋白Myo Ⅹ的表达载体构建

1、特异性沉默靶蛋白Myo Ⅹ的序列设计