[发明专利]永生化人脐带间充质干细胞系及其建立方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种永生化人脐带间充质干细胞，具体涉及一种能够稳定表达出人端粒酶催化亚基hTERT的干细胞系。本发明还涉及该干细胞系的建立方法和应用。

本发明还涉及一种含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体的构建。

背景技术：

人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells,以下简称为hMSCs）是可应用于再生医学方面及作为基因治疗的靶向细胞，在细胞替代与基因治疗方面具有广泛临床应用前景。

但hMSCs许多方面存在有待解决的问题，尤其是自体hMSCs在移植应用中数量不足，限制了临床应用。解决这一问题的主要途径应包括两个方面：一是增强hMSCs的增殖活力，二是应用异体或异种hMSCs。但异体移植有免疫学问题，因此，永生化的人间充质干细胞的建立是非常有意义的工作。

端粒是染色体末端串连、重复的TTAGGG序列，在正常细胞分裂过程中会逐渐变短。当端粒在一个或多个染色体中缩短到某一极限值时，细胞衰老和生长停止就会发生。端粒的长度是由端粒酶维持的。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶催化亚基，实验表明，外源性htert基因导入细胞可提高端粒酶活性，延缓细胞的衰老，保持了多向分化潜能并没有致瘤倾向。这说明用htert基因转染修饰hMSCs可以达到延长hMSCs生命周期、保持多向分化潜能的目的。

Simonsen J.L等通过逆转录病毒载体将hTERT转入人骨髓间充质干细胞hMSCs，筛选到的骨髓hMSCs细胞克隆在体外培养到200代，细胞无衰老迹象、并保持了多向分化潜能。本研究通过构建重组慢病毒载体plvx-htert，慢病毒载体感染效率高，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在细胞内长时间的表达且安全性高。

将人端粒酶的催化亚基hTERT导入到脐带间充质干细胞中，使细胞能够长期传代，建立起永生化的人脐带间充质干细胞系尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是，筛选出永生化的人脐带间充质干细胞，以解决干细胞取材难及细胞分裂有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的细胞来源。

本发明通过构建重组慢病毒载体plvx-htert，将人端粒酶的催化亚基基因htert导入到脐带间充质干细胞中，筛选出了能够稳定表达出hTERT的干细胞系，经过细胞培养及各种水平的鉴定，证明已经获得了永生化的脐带间充质干细胞系，该细胞系保持分化能力，没有致瘤倾向，可以作为表达各种抗原与抗体的基因载体。

本发明具体进行了以下研究：

1、构建了含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体plvx-htert。

与骨架质粒共转染293T细胞，成功地包装出含有htert的重组慢病毒，并测定了重组慢病毒的滴度。

2、筛选出阳性的hMSC-hTERT细胞系

用含有htert重组慢病毒载体感染分离到的第二代人脐带hMSCs，在嘌呤霉素的筛选下，成功地筛选出阳性的hMSC-hTERT，并继续培养，已成功地将hMSC-hTERT细胞培养到105代细胞。

将此细胞系进行了生物材料保藏，保藏编号为CGMCC No.6609。

3、用多种方法证明了上述所得hMSC-hTERT细胞系的生物活性、功能

1）用实时定量PCR及常规PCR技术在DNA、RNA及水平检测了htert基因的表达水平明显增加；

2）用端粒酶活性试剂盒（Trapeze telomerase detection kit）和银染的方法鉴定hMSC-hTERT细胞系具有端粒酶的活性；

3）细胞流式分析表明该细胞系表面标记均符合hMSCs特征；

4）用成骨试剂诱导hMSC-hTERT细胞系，碱性磷酸酶水平升高，证明能够诱导出成骨细胞，表明hMSC-hTERT仍然具有多向分化能力；

5）核型分析表明hMSC-hTERT具有正常的二倍体特征；

6）可作为基因治疗的有效的载体

将用于治疗EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的包含潜伏膜蛋白2（LMP2）基因的重组腺病毒感染hMSC-hTERT，免疫酶方法检测结果表明，hMSC-hTERT细胞系表达出LMP2蛋白。用含有2G12抗HIV中和抗体的重组慢病毒去感染该细胞系，用ELISA方法鉴定出细胞上清中能够表达出中和抗体2G12，浓度可以达到5μg/ml。因此，建立的hMSC-hTERT可以高效的表达外源基因，可作为基因治疗的有效的载体。