[发明专利]草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶及编码序列

说明书

 

技术领域：

本发明公开一种草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽及编码序列，具体是涉及到从土壤宏基因组中分离克隆的一个草甘膦耐受型EPSPS编码序列和蛋白产物，本发明还涉及此EPSPS的制备和用途，属于基因工程技术领域。

背景技术：

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase (EPSPS) (EC2.5.1.19)〕是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。有些微生物来源的EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，这一途径是生物产生草甘膦抗性的被动方式。草甘膦作为一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，自1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种（任不凡等，1998）。对大多数植物具有灭生性等其它除草剂不可比拟的优点。草甘膦作为一种灭生性除草剂，对农作物同样具有灭杀作用，这就限制了其使用范围和使用时间。如果能选育出抗草甘膦或降解草甘膦的农作物新品种，则既能显著节省农业生产费用，又能极大地促进草甘膦工业的发展。目前，我国尚无进入商品化阶段的抗草甘膦转基因作物，培育我国具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物具有迫切性。

土壤微生物中蕴藏着极其丰富的基因资源，但由于在绝大多数人为创造的环境中，可培养的细菌数量非常有限，通常低于1％。因此，人们对土壤基因资源宝库的了解和利用还十分有限。随着分子生物学技术的发展和微生物学研究手段的进步，宏基因组学为我们研究环境微生物(特别是目前尚不可培养的微生物)提供了手段。通过直接从环境中提取和克隆基因组DNA，理论上可以获得任何功能的基因序列。直接克隆基因组为我们获得操纵子或由复杂分子直接合成物质(例如抗生素)提供了机会，本发明提供的编码EPSPS的基因就是从土壤宏基因组中分离克隆得到的。

目前，国际上使用的抗草甘膦基因主要是美国Monsanto公司从农杆菌CP4中分离的cp4-EPSPS基因。Monsanto公司拥有cp4-EPSPS基因的多项专利，其专利覆盖了抗草甘膦基因cp4-EPSPS的重要变异位点。本专利公开的抗草甘膦基因不存在Monsanto公司EPSPS基因专利（专利号：US 5804425，200480009843.2）覆盖的氨基酸的变异位点。

发明内容：

本发明提供一种草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（以下简称为EPSPS）多肽及其编码序列，其编码的蛋白具有较强的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的活性，并具有良好的草甘膦抗性。

本发明公开的一种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于：

具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或是在SEQ ID No.1限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一个或多个氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽。

本发明公开的一种编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽的编码序列，其特征在于：

具有如SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列，具有编码如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或是在限定的多核苷酸序列中取代、缺失、添加一个或多个碱基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的编码序列。

本发明公开一种载体，其特征在于，它含有如SEQ ID No.2所述的多核苷酸。

本发明公开一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有如SEQ ID No.2所述的多核苷酸的载体。

本发明公开一种具有EPSPS活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

（a）在适合的表达条件下，培养含有如SEQ ID No.2所述的多核苷酸载体的宿主细胞；

（b）从培养物里分离出具有EPSPS活性的多肽。

本发明公开一种改变植物草甘膦抗性的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）携带如SEQ ID No.2所述的多核苷酸的载体的农杆菌；

（2）利用步骤（1）所述的农杆菌侵染植物的细胞，组织或者器官；