[发明专利]一种基于PCR-LDR技术的检测拷贝数变异的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及基于多重竞争性PCR以及LDR技术检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。

背景技术

拷贝数变异（copy number variations,CNVs）是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中1kb~3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。

随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检测，代表技术有微阵列比较基因杂交（SolinasToldo,Lampel et al Genes Chromosomes Cancer.1997Dec;20(4):399-407）、全基因组SNP芯片(Irving,Bloodworth et al.Cancer Res.2005Apr15;65(8):3053-8)、代表性寡核苷酸微阵列技术（Lucito,Healy et al.Genome Res.2003Oct;13(10):2291-305.Epub2003Sep15.）等，其优点是通量高且易于实现自动化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期长的缺点。后者主要是针对具体的目标位点进行检测，代表性的技术有实时荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA)（Schouten,McElgunn et al.Nucleic Acids Res.2002Jun15;30(12):e57）和多重可扩增探针杂交(MAPH)（Armour,Sismani et al.Nucleic Acids Res.2000Jan15;28(2):605-9.）等。实时荧光定量技术有操作简单、重复性好、实验周期短等优点，但是检测通量较小；与实时荧光定量PCR相比，MLPA和MAPH的检测通量有了很大提高，不过PCR微环境的变化会导致不同位点不能完全同步扩增，而且PCR的平台效应也会影响检测结果。以PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分开检测的，这样两者PCR效率的差异会引起检测结果的偏差。

竞争性PCR克服了这个缺陷，实现CNVs的快速、准确、经济的检测。在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用公式Y=A（1+R）ⁿ来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，n表示PCR的循环数，当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。竞争性PCR利用了这一原理，在同一PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核酸序列，用作内对照，两组模板仅在目标序列长度上（存在一些碱基的插入或缺失）存在一些差异，其他反应条件一致，因此两者扩增效率接近一致，两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板（待测样本和内对照不存在拷贝数差异）量的比，可以根据内对照的初始模板的量来计算待测样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当两模板具有相同的浓度或消除了浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值就反映模板拷贝数的差异。PRT法(Paralogue Ratio Test）（Armour,Palla et al.Nucleic Acids Res.2007;35(3):e19.Epub2006Dec14）是基于竞争性PCR的一种检测CVNs的一种方法，此方法的优点是待测位点和内对照共存于基因组序列中，但是缺点也是很明显的，只能针对有限的基因位点进行检测，而且针对不同检测位点都要设计一对荧光引物，加大了实验成本。

对于一些基于多重竞争性PCR的定量技术，因为其PCR产物的长度必须能清晰分离，这对PCR产物的设计提出了较高的要求。对于一些PCR产物长度相近的情况则无法进行检测。本发明就是利用LDR技术，对PCR产物的长度不提出要求，解决了多重PCR设计的难点。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题是克服现有技术一些多重竞争性PCR产物长度设计难点的问题，提供一种成本低、通量高、样本需求低、检测灵敏性高、普及度广的CNVs检测方法。

技术方案

在总结现有技术中各种检测方法的优缺点基础上，发明人经过自主创新研发，令人惊奇地发现通过如下设计，可以成功解决上述技术问题，并且成功应用于生物科学研究与临床分子诊断等领域。本发明的目的通过以下技术方案实现：