[发明专利]一种分离恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法

说明书

 

技术领域    本发明属于分离技术领域，涉及一种使用反相键合硅胶层析色谱分离纯化恩拉霉素的方法。

背景技术    恩拉霉素(enramycin) 又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由放线菌(Streptomyces fungicidicus)发酵而得，是不饱和脂肪酸与十几种氨基酸结合的多肽类抗生素，主要组分有恩拉霉素A和B，是其盐酸盐形式应用。对革兰氏阳性菌有显著抑菌作用，主要阻碍细菌细胞壁的合成。敏感细菌有金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、酿脓链球菌等。而肺炎球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌亦较敏感。白色或微黄白色粉末 (粗品呈灰色或灰褐色的粉末，有特臭)。234～238℃分解，易溶于稀盐酸、微溶于水、甲醇、乙醇，不溶于丙酮。

恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的活性，特别是对肠内的有害梭状芽孢杆菌(Clostridium)抑制力很强。长期使用后不容易产生抗药性，因它改变了肠道内的细菌群，所以对饲料中营养成分的利用效果好，可以促进猪、鸡增重和提高饲料转化率。

为了避免由于抗生素的滥用引起耐药菌株大量繁殖或使药物在畜产品中的残留量增大，对畜禽生长及人体健康造成直接危害，应用畜禽专用的抗生素饲料添加剂已迫在眉睫。由于恩拉霉素具有优良的促生长和改善饲料利用率的作用，恩拉霉素内服极不易被吸收，药物主要通过粪便排出体外。因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。市场上主要的来源是先灵葆雅公司的菌丝体预混剂。

恩拉霉素A的分子式为C107H138Cl2N26O31，分子量为2355；恩拉霉素B的分子式为C108H140Cl2N26O31，分子量为2369；如下图所示的化学式，恩拉霉素A和恩拉霉素B的区别在于R基团位置上恩拉霉素A位甲基，恩拉霉素B为乙基。为了对恩拉霉素A和恩拉霉素B进行有效的研究和检测，需要分离纯化获得较纯的单体化合物作为对照研究。

中国发明专利申请ZL200910032340.1《一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法》中记载用大孔吸附树脂安伯莱特XAD-4、安伯莱特XAD-16 等来分离提取恩来霉素。但该发明方法对于菌丝体中恩拉霉素的产率只能控制在60％～71％，回收率较低，对于规模化工业生产耗损太多，含量检测方面也难满足准确度要求。

中国发明专利申请201010213986.2《使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法》中使用了大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素，纯化过程中使用大量的强酸强碱处理离子交换树脂，导致废水处理难度加大，而且样品的溶液也使用碱性溶液调节，从而导致样品的不稳定性。同时按以上方法获得的样品纯度为AB两种物质的总纯度。

因此需要一种简单易操作的方法快速的分离纯化获得恩拉霉素A和恩拉霉素B纯品。

发明内容   本发明的目的是提供一种分离恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其包括如下步骤：步骤1，取含恩拉霉素A和恩拉霉素B的混合物进行溶解，溶解液为30%甲醇的盐酸水溶液，pH为3.0-4.0；步骤2，将粒径为10-50μm的十八烷基反相键合硅胶层析填料用甲醇浸泡后，装柱，再用含30%甲醇的pH4.0-5.5的0.01-0.05M磷酸二氢钠-磷酸水溶液平衡层析柱后制成反相层析柱备用；步骤3，将步骤1中溶解液上样反相层析柱，上样量为1-10mg混合物/mL填料体积，再用4-6倍填料体积的步骤2中的磷酸二氢钠-磷酸水溶液洗脱杂质，形成含有恩拉霉素A和恩拉霉素B的反相层析柱；步骤4，采用1-3倍填料体积的含有32%-36%甲醇的步骤2中的磷酸二氢钠-磷酸水溶液对步骤3得到的含有恩拉霉素A和恩拉霉素B的反相层析柱进行洗脱，收集得含有恩拉霉素A的洗脱液A；步骤5，采用3-6倍填料体积的步骤2中的磷酸二氢钠-磷酸水溶液洗脱，逐步提高磷酸二氢钠-磷酸水溶液中甲醇含量至40%进行梯度洗脱，弃洗脱液；步骤6，采用3-8倍填料体积的含有40%-50%甲醇的步骤2中的磷酸二氢钠-磷酸水溶液对步骤4处理后的反相层析柱进行洗脱，收集得含有恩拉霉素B的洗脱液B。

本发明的步骤1中恩拉霉素A和恩拉霉素B的总重量占混合物总重量的50%以上，恩拉霉素A和恩拉霉素B的重量比为1:0.5-1.5。

本发明的步骤1中溶解混合物的30%甲醇的盐酸水溶液用量为0.25-0.5mL/mg混合物。