[发明专利]表达对氧磷酶1基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达对氧磷酶1基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于生物制药技术领域。

背景技术

对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)广泛存在于多种微生物、昆虫、蛇毒、鱿鱼轴索、鱿鱼后唾液腺、鸟类及哺乳动物中，是生物体内存在的一种广谱的非专一性酯酶。它能通过催化磷酸酯键的水解，来降解有机磷酸、芳香羟基酸酯和氨基甲酸酯，从而对水解有机磷杀虫剂及降解神经毒剂发挥重要作用。因此对氧磷酶1有望成为有机磷中毒预防和治疗的新途径。据报道，PON1不但在有机磷毒剂解毒中起重要作用，而且与哺乳动物的动脉粥样硬化、冠心病及Ⅱ型糖尿病的发病等有密切关系，同时PONs还可以淬灭群体感应信号分子，干扰细菌群体感应信号系统(Quorum sensing，QS)，这一发现揭示了哺乳动物抗细菌感染的新机制。

当前恐怖主义泛滥、有机磷农药中毒和自杀的事件时有发生，针对神经中毒传统的治疗方法是采用阿托品和氯解磷定，通过间接抑制M受体和复活磷酰化的胆碱酯酶达到解毒目的，但治疗中存在阿托品中毒及中毒反跳等不足。由于PON1可以直接水解多种有机磷类化合物，且其水解产物可以直接从体内代谢出去，因此对氧磷酶1的发现极有可能为有机磷中毒的预防和治疗提供一条新的途径。

近年来研究发现，PON1还具有抑制低密度脂蛋白氧化的作用，与动脉粥样硬化，慢性肝损伤、冠心病及Ⅱ型糖尿病的等多种疾病的发病有密切关系。

利用大肠杆菌表达的PON1有其自身的优点，如廉价，生产周期短等，但表达的蛋白缺少糖基化及磷酸化修饰，在体内应用时存在免疫排斥，半衰期短，易降解等不足(大肠杆菌原核表达系统没有翻译后加工系统，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，从而使部分对糖基化要求成都较高的基因不能在该系统中进行功能性表达)。孙曼霁等(滕霞,杨申,李前,孙曼霁,等.人血清Q型对氧磷酶在大肠杆菌中的表达[J].生物技术通讯，2007(18)：15-18)曾应用大肠杆菌系统表达人Q血清对氧磷酶，结果显示所表达对蛋白均以包涵体形式存在，包涵体经过分离、变性、复性等步骤处理后，产物未显示有酶活性。姬爱国等(姬爱国，淮亚红，张路培，等.牛对氧磷酶1基因和对氧磷酶2及in原核表达载体的构建极其表达分析[J].生物技术通讯，2008，35(9)：59-63)克隆出牛血清对氧磷酶基因，并利用基因工程方法初步表达出具有活性的对氧磷酶PON1，但未得到纯化的重组蛋白。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达对氧磷酶1基因的家蚕重组杆状病毒，通过杆状病毒表达系统将PON1基因构建到家蚕生物反应器中进行高效表达，比原核表达增加了糖基化的功能，更接近哺乳动物表达的天然修饰功能，而且家蚕作为一种廉价低成本生物反应器可以大大降低外源基因表达的成本。

为达到上述目的，本发明提供一种表达对氧磷酶1基因的家蚕重组杆状病毒，该病毒含有对氧磷酶1基因。

优选地，其中所述对氧磷酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种上述家蚕重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1) 对氧磷酶1基因的合成；

(2)将步骤(1)所合成的对氧磷酶1(PON1)基因连接到转移载体上，并转化大肠杆菌TG1感受态细胞，构建重组转移载体；

(3)将步骤(2) 构建的重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状病毒DNA；

(4)将步骤(3)得到的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞，得到家蚕重组杆状病毒。

优选地，其中步骤(1) 所述对氧磷酶1基因的合成具体包括：

(1)设计上游引物F: 5’-TATGAATTCATGGCTAAACTGACAGCG-3’ ，其中斜体为 EcoRⅠ位点；

下游引物R：5’-GCGCTCGAGTTACAGCTCACAGTAAAG-3’ ，其中斜体为XhoⅠ位点； 

(2)以pBlueScript-PON1质粒为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为：95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次；最后72℃延伸45s，回收产物，得到对氧磷酶1(PON1)基因，经测序比对后发现得到的基因序列与设计一致。

优选地，其中所述步骤(2)具体包括：