[发明专利]一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物农药的检测方法，具体涉及一种用于测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法。

背景技术

微生物农药通常包括细菌、真菌和病毒微生物农药。是直接利用细菌、真菌和病毒等产生的天然活性物质或生物活体本身开发的，对植物病虫草割进行防治的农药。这类农药具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不任务天敌、不易产生抗性等优点。微生物农药中的含菌量(尤其是活菌量)是决定产品质量好坏和田间防治效果的重要因子，因此活菌量是微生物农药产品质量检测的一项重要技术指标。

由于微生物农药的有效成分为活体，不能用化学农药的分析仪器进行含量检测。对于真菌微生物农药，通常采用血球计数板结合孢子萌发的方法进行检测，即先用血球计数板测定总的孢子含量(样品称量、稀释、血球计数板计数、结果计算)，然后测定孢子萌发率(样品称量、稀释、孢子培养、显微观察孢子萌发情况、结果计算)，最后计算活的孢子含量(总的含孢量×孢子萌发率)。上述方法存在以下主要缺点：操作繁琐，在显微镜下不易区分真菌孢子和助剂颗粒，而且由于培养时间短，有的孢子尚未萌发，影响测定结果。

近年来，一些真菌微生物农药如球孢白僵菌、绿僵菌、木霉、淡紫拟青霉等在国内陆续获得登记，生产上和市场上急需建立这类农药的快速、简便、准确的产品质量检测方法。

一种考虑是采用平板菌落计数的方法来直接获得活孢子的含量，但是，按照普通用于细菌计数的平板菌落计数法对真菌进行操作的话，不同孢子的菌落会长在一起连成片，形成大的菌落，影响测定结果；而菌落太小时计数则看不清，且不能区分目标菌落和杂菌的菌落。因此，需要寻找改进的方法。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，以简化操作，获得更为准确的检测结果。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，包括下列步骤：

(1)在真菌培养基中加入以重量计0.25‰～5‰的脱氧胆酸钠，并制备成平板；

(2)将真菌微生物农药样品在含重量百分比0.05％～0.1％吐温20或0.05％～0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的灭菌水中浸泡20～40min，再振荡20～40min；

(3)将步骤(2)处理后的样品进行倍数梯度稀释，分别将不同稀释度的样品均匀涂布在步骤(1)获得的平板上，室温下培养48～120h，其中，同一稀释度制作至少2个重复样品；

(4)统计各平板上的菌落数，其中菌落数在30个～300个的平板为有效计数平板；

(5)真菌微生物农药中，活孢子的含量为：

C＝T×N×10，

式中：C是真菌农药活孢子含量，单位为CFU/g；T是统计平板对应的稀释倍数；N是同一稀释倍数的多个有效计数平板上的平均菌落数。

脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate，CAS号：302-95-4)，中文别名为3α，12α-二羟-5β-胆烷酸钠以及去氧胆酸钠，系胆酸盐，类似胆汁气味，有强烈苦味，易吸湿，易溶于水，微溶于无水醇，不溶于醚，低毒，半数致死量(大鼠，经口)1370mg/kg，化学结构式如下：

脱氧胆酸钠为离子型去垢剂，是一种应用较广泛的生化试剂，其作用主要有：裂解细胞、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等。此外，胆酸盐是重要的生物活性分子，能参与许多生理过程；被广泛应用于粘膜和皮肤给药的促吸收剂。

本发明将脱氧胆酸钠添加到培养基中，能够抑制真菌的菌落扩展，同时在低浓度下也不会让真菌孢子致死，实现了采用平板菌落计数法一步直接获得活孢子的含量，而且可以通过肉眼或菌落计数仪统计菌落数。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述真菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，将培养基高压蒸汽灭菌，待冷却到55～62℃时，向培养基中加入脱氧胆酸钠，制备成平板。

步骤(2)中，所述振荡在室温、150rpm的条件下进行。

优选地，步骤(2)中，浸泡时间为30min，振荡时间为30min。

步骤(3)中，采用10倍数梯度稀释，同一稀释度制作3个重复样品。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：