[发明专利]月季RcHSP70基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、生理学以及基因工程等领域，具体涉及一种月季RcHSP70基因及其应用，特别是涉及一种在月季中表达的RcHSP70（月季热激蛋白，Rosa chinensis Heat shock protein，RcHSP70）的克隆，基因表达模式分析，转基因载体的构建，大肠杆菌的转化，转基因菌株的获得及其在提高多种非生物胁迫抗性方面的应用，以及所述基因在提高转基因植物的温度抗性中的应用。 

背景技术

由于“温室效应”现象日益明显，全球气温持续升高，夏季高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子，植物生长发育面临高温逆境的严峻挑战。热激蛋白(heat shock protein,HSPs)是HSPs一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白，根据分子质量大小将其分成HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子热激蛋白（smHSPs）。HSP70s属于大分子热激蛋白。热激蛋白是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。有机体在受到逆境胁迫后，体内变性蛋白急剧增加，热激蛋白可以与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态，在有Mg²⁺和ATP的存在下使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象。已有研究证明HSPs的主要功能是参与新生肽的折叠以及蛋白质变性后的复性、降解，维持胞内环境的稳定，起分子伴侣(molecular chaperones)的作用。 

虽然植物热激蛋白的研究起步较晚，但已成为当今分子生物学、蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研究内容，其中心问题是HSPs的生物学功能。大分子热激蛋白既可以作为常温下细胞结构蛋白，也可以作为高温热激下的一种保护性蛋白，其中HSP70家族是热激蛋白中研究最多、了解最深入的一个家族，它的成员遍布于细胞的各个组分，如胞质、内质网、线粒体和叶绿体（Vierling,1991,Frydman,2001）。HSP70功能包括：与新合成的多肽结合，参与新生多肽链的折叠及促进蛋白质复合物的形成；引导多肽到达不同的细胞器；在热激情况下，通过与变性或异常状态的蛋白质结合来防止它们凝聚从而避免细胞结构的崩溃，促进变性蛋白质的复性（Skcwyra等,1990;Buchner等,1992;Hartl,1996）。HSP70与ATP的高度亲和性表明其在行使功能时需要ATP水解放出的能量。 其它大分子HSPs均已证明具有分子伴侣功能，并且也有越来越多的证据表明，大分子HSPs的作用途径是相同的，其功能有部分重叠或是互补，HSPs通过协同作用来更好的行使分子伴侣功能（Bukau和Horwich，1998；Easton等，2000；Sung等，2001；Wang等，2004）。 

许多研究表明，HSPs的生成量与生物耐热性呈正相关。也有研究表明HSPs与植物的抗冷性相关，Collins等（1995）首先证实了HSPs和耐冷性的直接关系。 

随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种月季RcHSP70基因，将该月季RcHSP70基因转入大肠杆菌后可以提高转基因菌株对高温、低温的抗性，应用该技术不仅可以提高原核生物的温度抗性，而且还可以提高转基因植物的温度抗性。 

所述的月季RcHSP70基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为1956bp。该基因是一个大分子热激蛋白基因，因此又称月季RcHSP70基因。 

所述的月季RcHSP70基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2，由651个氨基酸残基组成，分子量为71118.813道尔顿，pI为4.975。 

本发明所要解决的技术问题之二在于一种检测所述月季RcHSP70基因表达模式的分析方法，包括以下步骤： 

1）将耐热性能差异显著的两个月季品种二年生嫁接苗于25℃常温及38℃热激处理3小时，分别提取它们嫩叶的总RNA。 

2）将总RNA反转录成cDNA，然后根据所述月季RcHSP70基因的开放阅读框的特异序列设计一对引物，其中正向引物的序列为：5’-ATGGCCGGAAAGGGAGAG-3’，反向引物的序为：5’-TTAGTCAACTTCTTCAATCT-3’，进行PCR。电泳之后，用相对定量软件进行分析。