[发明专利]一种白酒酿造微生物的高质量DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及白酒微生物群落生态技术领域，具体是一种用于白酒酿造微生物群落结构分析的高质量DNA提取方法。

背景技术

中国白酒有着悠久的酿造历史，而且中国白酒的酿造工艺不尽相同，中国白酒的酿造生产以大曲作为微生物及酶的主要来源，在实际生产中，大曲质量的优劣关系到白酒的出酒率及酒的品质。在大曲的生产过程中伴随着一系列微生物此消彼长的驯化过程，大曲当中微生物的群落结构直接关系到大曲的生产质量。中国白酒主要以窖池及酒醅等作为生产基础，环境、大曲及窖泥当中的微生物进行着复杂的能量代谢和物质代谢，微生物复杂的代谢过程也是白酒风味前体物质的形成过程，研究不同工艺生产的大曲、同一大曲制曲过程及窖泥中微生物的群落差异及变迁，对于大曲及白酒的生产具有一定的指导意义。与本发明相关的技术有DNA提取方法和DNA提取试剂盒等，有如专利申请号为 201210107413.0记载了一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，包括以下步骤：(1)称取适量窖泥，放入灭菌的离心管中，加入灭菌生理盐水，充分振荡，离心，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；(2)向上述样品加入无水乙醇，充分振荡，离心，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；(3)加入无菌超纯水，混合均匀，振荡洗涤样品，离心，弃去上清液；(4)将充分洗涤的窖泥样品用双层灭菌纱布包裹离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于-20℃冰箱，用于提取窖泥微生物总DNA。有如专利申请号为 201010266385.8记载了涉及一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法，主要步骤如下：1)：直接提取大曲基因组DNA；2)：选择细菌通用引物，扩增细菌核糖体DNA中的特异性DNA片段；3)：DGGE电泳分离PCR产物；4)：切胶回收DGGE指纹图谱中微生物对应的条带；5)：重新PCR，将产物连接至T载体，蓝白斑筛选并进行阳性克隆验证；6)：测序获得DGGE条带对应微生物的种属信息。有如专利申请号为 201210107413.0记载了一种白酒大曲中微生物总DNA提取的方法，其特征在于在提取DNA之前对白酒大曲进行前处理，前处理包括如下步骤：取大曲，加入前处理液：含0.05-0.2W/V％PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V％土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，其中大曲和前处理液的重量体积比为3-8∶25，振摇；超声处理；静置后低速离心；取上清液，高速离心；去除上清液沉淀加入0.05-0.2W/V％PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸缓冲液；打散后高速离心，去除上清液，得到样品。但是，现有的技术方法中存在以下缺陷：⑴ 基因组DNA提取方法应用的范围较窄（仅仅是大曲或窖泥），而普遍适用的方法鲜见；⑵ 前处理方法中加入了一定的絮凝物，但絮凝物对微生物群落中丰度较低的微生物的影响不可估量；同时，由于大曲及窖泥的微生态环境很复杂，有很多的干扰成分存在，获得的基因组总DNA的质量并不理想。因此，一种适用范围广泛、简单易行的能够从大曲、糟醅和窖泥中提取高质量DNA的有效且稳定的方法是迫切需要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用范围广泛、简单易行的能够从大曲、糟醅和窖泥中提取高质量DNA的有效且稳定的方法。其具体步骤如下：

⑴样品预处理

称取一定量的大曲，加入30mL PBS 缓冲液（0.0557mol/L Na₂HPO₄，0.0423mol/L NaH₂PO₄，pH8.0），涡旋均匀，800r/min离心10min，取上清液，并10000r/min离心10min得固态菌团。

⑵DNA提取与检测