[发明专利]一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法

权利要求书

1.一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法, 其特征在于通过电化学还原法制备石墨烯/三维纳米金复合材料，构建电化学DNA生物传感器，利用DNA杂交前后安培电流强度的变化来实现对目标基因及含survivin片段的阳性PCR产物的测定。

2.根据权利要求1所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于石墨烯/三维纳米金复合材料的制备采用一步电化学还原法，且所述的目标基因序列为survivin基因的一个片段，通过NCBI基因数据库同源比对，该片段为survivin的特异序列。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于依序包括如下步骤：（1）玻碳电极预处理；（2）石墨烯/三维纳米金复合材料修饰玻碳电极的制备；（3）探针的自组装及与目标基因或PCR产物、末端生物素修饰的信号探针杂交；（4）亲和素修饰的辣根过氧化物酶（HRP）与生物素结合；（5）电极在TMB溶液中，在HRP的催化下产生电化学信号，通过杂交前后电化学信号的变化可检测目标基因及阳性PCR产物。

4.根据权利要求3 所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于制备的石墨烯/三维纳米金复合材料修饰玻碳电极，具有大的比表面积，高导电及电催化能力，增强了该传感器的灵敏度。

5.根据权利要求3 所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于探针、目标基因及信号探针通过形成三明治结构而杂交，确保了该传感器的特异性。

6.根据权利要求3 所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于杂交后，通过生物素及亲和素结合而使HRP固定在电极表面，利用酶联放大技术，在HRP催化下，TMB底液发生氧化还原反应，产生放大的电化学信号，增强了该传感器的敏感性。

7.根据权利要求3 所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于玻碳电极依次在1.0，0.3，0.05 μm 的Al₂O₃粉末中打磨、抛光，然后分别放入浓HNO₃与水的体积比V _HNO3 : V_H2O为1: 1的HNO₃、无水乙醇及去离子水中超声并用N₂吹干；用移液枪将8 μl 1 mg/ml的氧化石墨滴在处理干净的GCE表面，放入真空泵中直至表面干燥，将GO膜修饰的GCE放入2.8 mM HAuCl₄及0.1 M H₂SO₄ 中，通过循环伏安法，控制电位为0至-1.5 V合成石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极；合成的G- 3D Au/GCE在去离子水中超声后，在0.5 M H₂SO₄ 中进行循环伏安法扫描，控制电位为-0.35-1.5V，扫速为0.1 V/s。

8.根据权利要求3或7 所述的一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，其特征在于取5 μL浓度为10 μM的巯基修饰的捕获探针滴于处理好的G- 3D Au/GCE表面，在室温下反应后，用PBS缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在2.5 mM 6-巯基-1-己醇水溶液中封闭，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE，然后用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；在杂交反应前，用BSA封闭5-30分钟；分别将不同PCR实际产物，阴性PCR产物在95℃下变性10 min后，置于4℃ 冰浴中备用；将修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE电极放入到100 ml含有一定浓度的信号探针和变性后的PCR产物的杂交溶液中，在37 C下杂交后，取出并用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；用BSA封闭后，用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；然后，在电极表面滴加5 μl avidin-HRP 酶储备液，室温下反应，用含吐温的PBS缓冲液及PBS缓冲液清洗，获得修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE电极；将修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE电极置于含3，3’，5，5’—四甲基联苯胺（TMB）和H₂O₂的底液中，在HRP的催化下，H₂O₂能氧化 TMB生成双偶氮联苯胺类物质，从而产生电化学信号，根据电信号的差异可以辨别阳性PCR产物，阴性PCR产物及空白溶液。