[发明专利]串珠镰刀菌素胶体金试纸条的制备及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中残留物质的检测方法，特别是一种串珠镰刀菌素胶体金试纸条的制备及使用方法。

背景技术

串珠镰刀菌素是某些镰刀菌的代谢产物，因最初是由Cole等人于1973年自串珠镰刀菌的培养物中提取出来的，而被命名为串珠镰刀菌素串珠镰刀菌素。该菌素为水溶性，对动物各器官，特别对心血管有极强的毒性作用。串珠镰刀菌的化学名为3，4-二酮-1-羟基环丁烯，自然界中以钠盐或钾盐的方式存在。它是淡黄色针状结晶，具有水溶性。串珠镰刀菌素的毒性很强，小鸡经口LD₅₀为4.0mg/kg。急性中毒的大鼠可导致进行性肌肉衰弱。呼吸困难，发绀，昏迷和死亡。有人认为某些疾病与摄食玉米有关。该毒素的毒理作用是选择性抑制ɑ-氧化戊二酸盐脱氢酶和丙酮酸盐脱氢酶系统。Wilson等发现了串珠镰刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和饲料中，串珠镰刀菌素的检测方法有薄层色谱法，气象色谱法，气-质联机和高效液相色谱法，由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，且操作简单方便，对样品经过简单处理即可检测的串珠镰刀菌素快速试纸半定量检测方法。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：

串珠镰刀菌素胶体金试纸条检测方法其技术要点是：试纸的背衬上依次贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，金标垫上标记的物质为第二种属动物蛋白与串珠镰刀菌素检测用抗原的混合物或第二种属动物蛋白与串珠镰刀菌素抗体的混合物；硝酸纤维素膜上包被有串珠镰刀菌素抗体1条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线或包被有串珠镰刀菌素检测用抗原1条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的工IgG 1条作为参考线。在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。

所述的检测用抗原是指串珠镰刀菌素与载体物质明胶形成的偶合物，免疫用抗原是指串珠镰刀菌素与载体物质匙孔血蓝蛋白（KLH）形成的偶合物。

所述的载体物质也可以选用其他大分子物质，如：脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清白蛋白等，但要求检测用抗原与免疫用抗原的载体无交叉免疫反应。

所述的第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为兔源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、猪血清白蛋白等鸡、鸭或其他非兔源性动物蛋白。

本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下：

背衬：为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用；

样品垫制备：将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH 7.0- 8.4的PBS中约莫2 min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作为样品垫，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动；

胶体金标记部分的制备：该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用；制备步骤包括胶体金溶液的制备、胶体金标记串珠镰刀菌素抗原或串珠镰刀菌素抗体；

胶体金标记部分处理：

(1)胶体金溶液的制备：将氯金酸（ HAuCl₄）用超纯水配制成1%的母液，取1 mL的母液，用超纯水定容至100 mL，配成0.01%的溶液，加热至沸腾，加入1–5 mL 1%的柠檬酸三钠水溶液，继续加热至出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶液；

(2)胶体金标记串珠镰刀菌素抗原：将串珠镰刀菌素检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS（0.01mo1/L，pH 7.0-7.5）溶解稀释至2-4 mg/mL，每100 mL胶体金溶液加入1-3 mL 2-4 mg/mL的检测用抗原和1-1. 5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白震荡2 min，用0. 2mol/L的K₂CO₃：，调节pH至8.4，震荡5 min加入11% PEG-10000 2 mL，震荡5 min，8000-15000r/min离心15 min，除去上清，将沉淀用PBS（0. 0l mol/L，pH 7.0-7.5）复溶，以6000-13000r/min离心15 min，除去上清，将沉淀用PBS（0.0l mol/L，pH 7.0-7.5）稀释500-2000倍产物作为金标记串珠镰刀菌素抗原；