[发明专利]荧光猝灭体系存在内滤效应时荧光猝灭率的精确校正方法

权利要求书

1.荧光猝灭体系存在内滤效应时荧光猝灭率的精确校正方法，所述荧光猝灭体系是指：存在荧光内滤效应、且荧光物质与猝灭剂混合后不生成基态复合物的荧光测试样品；其特征是所述校正方法按如下步骤进行：

a、校正竞争吸收对光谱的影响：

以函数I₁(λ)表示未加入猝灭剂之前荧光物质受激发后所产生的荧光测量谱，以函数I₁'(λ)表示加入猝灭剂后荧光物质实际发出的荧光谱，则有：

I1′(λ)=10-ΔE1(1-10-ΔE2)[1-10-n(ΔE1+ΔE2)](1-10-n·ΔE2)[1-10-(ΔE1+ΔE2)]×I1(λ)---(1)]]>

式（1）中，ΔE₁=ε₁c₁Δl为猝灭剂对应激发波长的元消光度；ΔE₂=ε₂c₂Δl为荧光物质对应激发波长的元消光度；Δl为样品细分单元层的厚度；n为样品细分单元层的层数；ε₁为猝灭剂对应激发波长的摩尔吸收系数；ε₂为荧光物质对应激发波长的摩尔吸收系数；c₁为猝灭剂的摩尔浓度；c₂为荧光物质的摩尔浓度；

令：测量荧光谱时所用样品池的宽度和厚度均为L，设想将样品池中的样品细分为一系列与激发光垂直的等厚单元层，则Δl、n、L三者间的关系为：n×Δl=L；

b、校正再吸收对光谱的影响：

以函数I₂(λ)表示加入猝灭剂后混合样品的荧光测量谱，以函数I₂'(λ)表示经猝灭过程后实际发生的荧光谱，则有：

I2′(λ)=10n2ΔE1(λ)×I2(λ)---(2)]]>

式（2）中，ΔE₁(λ)=ε₁(λ)c₁Δl为猝灭剂与波长相关的元消光度函数；ε₁(λ)为猝灭剂与波长相关的摩尔吸收系数函数；c₁为猝灭剂的摩尔浓度；Δl为样品细分单元层的厚度；n为样品细分单元层的层数；

c、校正吸收分布对光谱的影响：

①任选一种荧光试剂配制成溶液，然后逐次稀释降低溶液的浓度，记录浓度值、并测量相应的荧光谱；对于不同浓度值所对应的荧光谱，分别利用比尔定律计算样品对激发光的吸收量以及样品池前十分之一光程对激发光的吸收与总吸收的百分比D_i，并计算相应的荧光积分强度S_i；

②计算荧光积分强度S_i与样品对激发光的吸收量的比值，并进行归一化处理，得到数据C_i；

③根据样品池前十分之一光程对激发光的吸收与总吸收的百分比D_i和数据C_i，做出二者的关系曲线C(d)；

④针对步骤a中函数I₁(λ)所代表的荧光测量谱，利用比尔定律计算荧光物质在前十分之一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分比D_j1,并根据关系曲线C(d)确定与D_j1对应的参数值C_j1；

⑤针对步骤b中函数I₂(λ)所代表的荧光测量谱，利用（3）式计算荧光物质在前十分之一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分比D_j2,并根据关系曲线C(d)确定与D_j2对应的参数值C_j2；

IX=I0·10-ΔE1·(1-10-ΔE2)·[1-10-n(ΔE1+ΔE2)]/[1-10-(ΔE1+ΔE2)]---(3)]]>

式（3）中，I₀为入射激发光强度，I_X为加入猝灭剂后荧光物质对激发光的吸收；

d、计算荧光猝灭率：

分别计算函数I₁'(λ)和I₂'(λ)的荧光积分强度，记为I_1s'和I_2s'，然后按（4）式计算猝灭率Q：

Q=Ils′Cj1·Cj2I2s′---(4)]]>

由式（4）计算所得的Q值就是经过精确校正处理后的荧光猝灭率，该数据消除了荧光内滤效应及吸收分布的影响，与实际猝灭过程相对应。