[发明专利]用于鉴定小麦春化基因VRN-A1的PCR体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-A1的PCR体系及其应用，特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-A1的多重PCR引物对组、试剂盒及其应用。

背景技术

春化阶段是小麦生长发育的基本阶段之一。小麦的春化反应与其生育期及适应性密切相关，是指导小麦区划和新品种推广的主要依据之一，受春化基因控制。春化基因决定小麦全生育周期长短的70~75%。Iwaki和Van Beem等研究表明，世界不同地区小麦品种的春化基因组成存在差异，反映了不同生态类型对品种春化反应的要求不同。

春化基因VRN-1编码的蛋白为MADS-box转录因子，受低温诱导促进开花，是普通小麦春化作用的一类主要基因，包括3个位点VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1，分别位于5A、5B和5D染色体长臂上。3个基因位点不同的等位变异对春化作用的效应不同，显性等位变异Vm-A1的效应最强，表现为对春化作用高度不敏感，同时对Vrn-B1和Vrn-D1位点基因具有上位性效应；显性等位变异Vrn-B1和Vrn-D1对春化作用的敏感性较弱，两者之间未发现彼此间的上位作用。Yan和Fu等发现，VRN-1春化基因变异类型受其启动子区和第一个内含子区决定。在普通小麦中，VRN-A1位点有4种变异类型，分别为Vrn-A1a、Vrn-A1b、Vrn-A1c和vrn-A1，其中Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c表现为显性，vrn-A1为隐性；VRN-B1和VRN-D1位点一般通常存在两种等位变异类型，即显性和隐性等位变异。与隐性等位变异类型相比，显性等位变异Vrn-A1a和Vrn-A1b分别在启动子区域插入和缺失了一定数量的碱基序列，而显性Vrn-A1c、Vrn-B1和Vrn-D1在第一个内含子序列出现了大片段碱基的缺失。

在普通小麦中，VRN-A1位点存在4种等位变异，需要用3对引物分别进行3次PCR检测；VRN-B1和VRN-D1位点两种等位变异，需要用两对引物分别进行两次PCR检测。为此，检测1个小麦材料春化基因VRN-1的3个位点等位变异组成，需要连续进行7次PCR检测，检测程序繁琐，实验成本高。

多重PCR这一概念自1988年由Chambercian等提出后，由于其快速、高效、低成本等一系列的优点，使得这项技术在生命科学领域得到了广泛的应用，如植物种质纯度鉴定、植物分子育种、植物病虫害检测等。利用多重PCR技术，在同一个PCR反应体系中加入两对或两对以上特异性引物进行扩增，可以同时检测出多个等位变异类型，降低检测成本，提高效益。

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组、试剂盒，以及利用所述多重PCR引物对组鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的方法。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组，由特异于所述VRN-A1基因的两个引物对组成；

所述特异于VRN-A1基因的两个引物对分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。

其中，序列1由20个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成。

本发明中，所述VRN-A1基因有四个等位基因，分别是Vrn-A1a、Vrn-A1b、Vrn-A1c和vrn-A1（前三个表现为显性，最后一个表现为隐性）。

所述引物对组中，所述序列1、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为1~1.5：1~1.5：1~1.5：1~1.。

在本发明的一个实施例中，所述引物对组中，所述序列1、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为1：1：1：1。

含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述引物对组的制备方法也属于本发明的保护范围。

该引物对组的制备方法可包括将所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装的步骤。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。

该试剂盒的制备方法可包括如下步骤：将所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。