[发明专利]串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物质的检测方法，特别是一种串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒的发明。

背景技术

串珠镰刀菌素是某些镰刀菌的代谢产物，因最初是由Cole等人于1973年自串珠镰刀菌的培养物中提取出来的，而被命名为串珠镰刀菌素串珠镰刀菌素。该菌素为水溶性，对动物各器官，特别对心血管有极强的毒性作用。串珠镰刀菌的化学名为3，4-二酮-1-羟基环丁烯，自然界中以钠盐或钾盐的方式存在。它是淡黄色针状结晶，具有水溶性。串珠镰刀菌素的毒性很强，小鸡经口LD₅₀为4.0 mg/kg。急性中毒的大鼠可导致进行性肌肉衰弱。呼吸困难，发绀，昏迷和死亡。有人认为某些疾病与摄食玉米有关。该毒素的毒理作用是选择性抑制ɑ-氧化戊二酸盐脱氢酶和丙酮酸盐脱氢酶系统。Wilson等发现了串珠镰刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和饲料中，串珠镰刀菌素的检测方法有薄层色谱法，气象色谱法，气-质联机和高效液相色谱法。由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。

发明内容

本发明为串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量，操作简便，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此，本发明还提供了专用试剂盒的制备及检测方法。其特征在于：包有串珠镰刀菌素固相抗原的包被板制备（包括串珠镰刀菌素酶标二抗，洗涤液，显色液，终止液等的制备），串珠镰刀菌素单克隆抗体的制备。

串珠镰刀菌素―牛血清白蛋白偶联物的制备：将串珠镰刀菌素溶解在3 mL-100 mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10 mL-100 mL蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20 mL，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到串珠镰刀菌素中间产物。取串珠镰刀菌素中间产物，加入3 mL-50 mL二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5℃-12℃下搅拌反应30分钟-45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸馏水和5 mL-50 mL二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8-9，5℃-12℃下搅拌反应5小时-6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次-5次，冷冻干燥，偶联物-20℃-40℃保存；上述反应成分的比例为：串珠镰刀菌素：羧甲基羟胺盐酸盐=（10-1000）mg：（10-2000）mg，串珠镰刀菌素中间产物：氯甲酸乙丁酯：BSA =（10-1000）mg：（10-1000）μL：（10-3000）mg。

串珠镰刀菌素―卵清蛋白偶联物的制备：将串珠镰刀菌素溶解在3 mL-100 mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10 mL-100 mL蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20 mL，弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到串珠镰刀菌素中间产物；取串珠镰刀菌素中间产物，加入3 mL-50 mL二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5℃-12℃下搅拌反应30分钟-45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸馏水和5 mL-50 mL二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8-9，5℃ - 12℃下搅拌反应5小时-6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次- 5次，冷冻干燥，偶联物-20℃-40℃保存；上述反应成分的比例为：串珠镰刀菌素：羧甲基羟胺盐酸盐=（10-1000）mg：（10-2000）mg，串珠镰刀菌素中间产物：氯甲酸乙丁酯：OVA =（10-1000）mg：（10-1000）μL：（10-3000）mg。