[发明专利]中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因的表达方法，特别涉及到中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法。 

背景技术

蜕皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节。这个调节过程表现为两种互为拮抗的激素作用。蜕皮激素的刺激作用和M IH的抑制作用。蟹类眼柄中所产生的MIH含量极微，并且家族其它神经肽在大小以及一级结构上的相似性限制了直接从动物体内分离并纯化MIH蛋白。因此，常常用原核及真核蛋白表达系统来生产较大量的重组MIH(Yodmuang et al.，2004；Lee and Watson，2002；Ohira et al.，1999；Sun，1997)。宋霞等(2003，2004)先后报道了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因Ers-MHII的部分cDNA序列及基因组DNA全序列(GeBnank检索号：AY310313)。Ers-MIHI成熟肽包括75个氨基酸，相对分子质量(M)r约为7.8kD，属于小分子多肽。本实验室的郭豫杰和姚燕曾将Ers-MIHI基因成熟肽的cDNA片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1载体和pET-28a(+)载体上，在大肠杆菌中进行了融合表达(郭豫杰等，2004；姚燕等，2006)，成功获得融合蛋白。但以pGEX-4T-1为载体获得的融合蛋白N端带有26kD的GST，庞大的标签蛋白可能导致目的蛋白的空间构象不正确，因此需要在纯化后用酶切去除标签蛋白部分。但经凝血酶切除GST后获得的目的蛋白一般N端残留两个氨基酸，而且切割后目的蛋白损失量较大，切割效率不高，从而导致融合蛋白往往检测不出活性，影响了目的蛋白活性及功能的研究。而以pET-28a(+)为载体的融合蛋白没有庞大的标签蛋白，以6His-tag为标签，不仅便于纯化而且分子量小，无免疫原性，不会影响被修饰蛋白质的生理pH值，对目的蛋白的分泌、构象或胞内折叠及纯化后的功能活性几乎无影响，不用设法切除(王华等，2002)。但由于目的蛋白在原核细胞内表达不稳定，易被细菌蛋白酶降解。 

基因工程的发展使许多微量蛋白大量表达，也使许多以前难以制备的蛋白得到表达成为可能。大肠杆菌E.coli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达。但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在 于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；真核蛋白在E.coli的表达会有更多的问题：由于真核基因通常含有内含子，在E.coli中不能进行正确的剪切和拼接，因此必须表达它的cDNA序列。另外，真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。 

发明内容

1、发明要解决的技术问题 

针对现有对中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达上的缺陷和不足，特别毕赤酵母表达系统对许多蛋白表达不理想，甚至不表达，要实现中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核在毕赤酵母中的成功表达并兼顾其实用性和安全性。必须充分考虑影响表达和应用的以下因素(1)目的基因特性的改造；(2)启动子的选择；(3)糖基化的消除；(4)提高产物的稳定性，本发明提供了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)基因的真核表达方法，获得实现生长发育和繁殖的人工调控奠定重要的基础。 

2、技术内容 

(1)发明原理： 

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最为广泛的酵母表达系统。由于该系统比原核生物及其它真核生物表达系统具有以下优点，已被广泛地用于外源蛋白的表达。 

①具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 

②作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 

③营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产； 

④具有强烈的好氧生长偏爱性，使得它既能高密度发酵生长，亦有利于工业放大生产，可进行细胞高密度培养，此外，Pichia pastoris能够忍耐较宽的pH范围(3.0-7.0)，利于在发酵过程中通过调节pH来抑制蛋白水解酶的活性，防止表达的外源蛋白的降解； 

⑤在P.Pastori中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外；