[发明专利]基于微流控芯片的体外血脑屏障模型的建立与表征方法

权利要求书

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要包括细胞入口池(1)、胶原入口池(2)、细胞培养室(3)和废液池(4)；细胞培养室(3)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(3)下连废液池(4)，每个胶原入口池分别含有4个观察小室，胶原入口池与细胞培养室(3)联通。

2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。

3.按照权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理45-60s进行不可逆封接。

4.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞入口池(1)、细胞培养室(3)、废液池(4)高度为胶原入口池(2)高度的三倍。

5.按照权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：所述胶原入口池(2)高度约为50μm；细胞入口池(1)、细胞培养室(3)、废液池(4)高度为150μm。

6.一种基于权利要求1所述的微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，其特征在于：方法过程如下：

(1)脑胶质瘤细胞条件培养液的制备

将脑胶质瘤细胞消化后，以5×10⁵-1×10⁶cells/mL密度接种入6孔板，恒温培养箱中培养24-36小时之后，弃去培养液，向孔板中加入无血清细胞培养液，恒温培养箱中继续培养48小时，收集该培养液备用；

(2)芯片内胶原的灌注

用移液器将配制好的胶原工作液注入胶原入口池(2)，将固定芯片的培养皿放入恒温培养箱中孵育30-45分钟，促使通道内胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶结束后，细胞入口池(1)、细胞培养室(3)和废液池(4)中加入新鲜的细胞培养液；

(3)芯片内细胞接种及血脑屏障模型的建立

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经消化后，调整合适的细胞密度，取10-20μL细胞悬液加入细胞入口池(1)内，从废液池端迅速吸出10-20μL细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室(3)；当在光学显微镜下观察到细胞培养室(3)中的细胞均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入恒温培养箱中放置，竖立方向为细胞培养室(3)在上，胶原入口池(2)在下；竖立放置8min后，取出观察，如果细胞紧贴于细胞观察室交界面，说明细胞接种成功；将芯片放平，向通道加入先前收集的脑胶质瘤细胞的条件培养液，移入恒温培养箱中继续培养48-60小时，每隔12-24小时换液一次；

(4)血脑屏障模型的结构表征及功能评价

常规免疫荧光染色法表征模型细胞表面紧密连接蛋白的表达；

以小分子(MW=557.47)荧光物质为探针，表征血脑屏障模型的渗透性，向细胞入口池(1)内加入小分子荧光物质溶液，分别测定0min、15min、30min后胶原入口池的4个观察室内的荧光强度。

7.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，其特征在于：所述步骤（2）芯片内胶原灌注时，胶原工作液加入胶原入口池(2)，每孔0.4μL；之后再加1mL PBS缓冲液于培养皿中。

8.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，其特征在于：所述脑胶质瘤细胞条件培养液的作用是对内皮细胞进行刺激，使其形成类似血脑屏障的细胞间紧密连接。

9.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，其特征在于：所述步骤（3）芯片内细胞接种时，所调整的细胞密度为5×10⁶-1×10⁷cells/mL。

10.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，其特征在于：所述的细胞表面蛋白表达检测的方法为常规细胞免疫荧光染色。