[发明专利]一种三聚氰胺衍生物及三聚氰胺单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，更具体地，本发明涉及一种三聚氰胺衍生物及三聚氰胺单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

三聚氰胺化合物因分子小，结构简单，直接偶联载体蛋白后，不能充分的暴露出小分子的空间结构，不利于淋巴细胞识别该小分子化合物，所以用未经改造的三聚氰胺分子直接偶联载体蛋白的这种抗原制备的抗体效价低，特异性差，无法满足检测试剂盒的研发的需求。

发明内容

本发明旨在至少解决上述技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种与载体蛋白连接后抗体效价高、特异性强的三聚氰胺衍生物。

根据本发明实施例的三聚氰胺衍生物具有如下分子结构式：

根据本发明实施例的三聚氰胺衍生物，相对于三聚氰胺多出了一个臂状结构，通过该臂状结构可以与载体蛋白相连接，连接所得抗原免疫原性好，特异性强，可刺激动物产生特异性的抗体，并且效价高，解决了很难单独用三聚氰胺化合物制备出有效抗体的问题。

本发明还提出了三聚氰胺衍生物的制备方法，其具体可以包括以下步骤：

a）将三聚氰胺（1.26g，10mmol）溶解于预热至40℃～50℃的二甲基酰胺（DMF 40mL）中，加入戊二酸酐（1.14g，10mmol）反应2h；

b）将反应后溶液冷却后加入乙醚10mL，产生白色沉淀；

c）过滤所述沉淀，并将过滤后固体进行重结晶，可得到1.8g三聚氰胺衍生物。

该方法操作简单易行，制备成本低，并且制备所得三聚氰胺衍生物用途广泛，适合推广使用。

本发明的另一个目的在于提出一种三聚氰胺衍生物在制备三聚氰胺单克隆抗体中的应用。

基于所述三聚氰胺衍生物相对于三聚氰胺多出了一个臂状结构，通过该臂状结构可以与载体蛋白相连接，连接所得抗原免疫原性好，特异性强，因此，可将所述三聚氰胺用于制备三聚氰胺单克隆抗体。

本发明还提供了三聚氰胺单克隆抗体的制备方法，其具体操作步骤可以包括：

A）将三聚氰胺衍生物与血蓝蛋白（KLH）通过偶联剂偶联，得到完全抗原；

B）将三聚氰胺衍生物与牛血清白蛋白（BSA）通过偶联剂偶联，得到三聚氰胺-蛋白偶联物（三聚氰胺-BSA）；

C）将所述完全抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后免疫试验动物，并在第四次免疫后的第十天取静脉血测定抗体效价；

D）将试验动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,分离筛选单克隆抗体细胞株；

E）将筛选的稳定的阳性克隆株扩大培养，接种试验动物，制备单克隆抗体腹水；

F）将所述抗体腹水分离上清，用Protein A亲和层析柱分离纯化，得到三聚氰胺单克隆抗体。

根据上述方法制备所得的完全抗原可以用于动物的免疫，得到的三聚氰胺-BSA可以用于检测抗体。

在本发明的实施例中，关于测定抗体效价的方法，没有特殊限制，例如可以采用竞争ELISA方法，其具体操作可以为：

以三聚氰胺-BSA包被酶联板，用1%BSA封闭，洗涤酶联板，将小鼠血清稀释成不同的比例，与酶联板上的抗原反应，免疫前小鼠血清做阴性对照，洗涤酶联板，再与辣根过氧化物酶标记的二抗反应，洗涤酶联板，过氧化氢作为底物，TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)显色，2N H₂SO₄作为终止液，于450nm测定OD值。其中，洗涤酶联板所用洗涤液为0.01M PBS,含体积百分百为0.05%的吐温-20，pH值为7.4。

本发明的再一个目的在于提出一种三聚氰胺衍生物在制备用于检测三聚氰胺的试剂盒中的应用。通过该试剂盒的应用，可以检测分析动物尿液、血液、肌肉、肝脏、牛奶及饲料等样本中的环丙沙星的残留量，还可用于癌症、心血管病、糖尿病或其他某些疾病患者的诊断和预后,具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。