[发明专利]肽聚糖结合蛋白BjApextrin1和BjApextrin2及其基因、生产方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新颖的肽聚糖结合蛋白基因及其编码的蛋白BjApextrin1和BjApextrin2，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。

背景技术

文昌鱼属于脊索动物门（Chordata），头索动物亚门（Cephalochordata），是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型，是五亿年前脊椎动物原始祖先的相似模型，一直以来是研究脊椎动物发育的好材料。近年来，对文昌鱼的免疫的研究引起了广泛的重视，在其中发现了不少具有重要意义的免疫基因。

肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）是几乎所有细菌的细胞壁的主要成分之一，尤其富含于革兰氏阳性菌中，也是宿主感知病原菌入侵、激活免疫反应的一种重要的病源相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）。肽聚糖可以被多种模式识别分子识别，如肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan recognition proteins，PGRPs），Toll样受体2（Toll-likereceptor 2,TLR2）等。

Haag等运用差显技术将胚胎发育模式不同的海胆进行对比，发现Apextrin在直接发育模式的红海胆（Heliocidaris erythrogramma）的胚胎中表达丰度明显高于间接发育的结节海胆，胚胎原位杂交显示Apextrin特异表达于紫海胆胚胎的外胚层。免疫组化实验证明Apextrin蛋白以分泌泡的形式储存在卵细胞里面，在卵细胞完成受精以后逐渐开始分泌，当胚胎在囊胚期极化之后Apextrin蛋白就定位于胚胎顶端胞外基质，故称其为顶端胞外基质蛋白（Apical extracellular matrix protein,Apextrin）。随后人们又分别在水螅,珊瑚中发现Apextrin基因，胚胎原位杂交显示Apextrin也可能参与了水螅和珊瑚的胚胎发育过程。

文昌鱼Apextrin基因的表达量在细菌刺激12h后上调了上千倍；红海胆在受到弧菌感染20h之后Apextrin蛋白的表达量也显著增加。我们发现文昌鱼的Apextrin可以能够识别和凝集革兰氏阳性菌，并且特异结合细菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作为制备治疗感染性疾病的药物，在养殖业、医药卫生等领域具有广阔的开发前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的肽聚糖结合蛋白BjApextrin1和BjApextrin2及编码该蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供该蛋白的生产方法。

本发明的第三个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。

本发明根据已有的EST序列通过5′和3′RACE,从中国文昌鱼的消化道中分离得到文昌鱼BjApextrin1和BjApextrin2基因,其DNA序列如序列表中序列1和序列2序列所示。

本发明所述基因编码的蛋白BjApextrin1和BjApextrin2，其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所示；该蛋白等电点分别为6.05和5.03，分子量分别为56,671和52,516道尔顿。

BjApextrin1和BjApextrin2克隆到大肠杆菌表达载体pET32a上，得到重组表达载体pET32a-BjApextrin1和pET32a-BjApextrin2。

该蛋白可以通过表达载体pET32a-BjApextrin1和pET32a-BjApextrin2在大肠杆菌以不溶的包涵体形式表达。

所述表达载体pET32a-BjApextrin1和pET32a-BjApextrin2以硫氧还蛋白为融合表达伴体，该系统使表达的BjApextrin1和BjApextrin2包涵体在硫氧还蛋白的帮助下通过变复性正确折叠成为可溶的蛋白。

本发明所选择的青岛文昌鱼（Branchiostoma japonicum）采集于山东省沙子口水域。

本发明根据已有的EST序列通过5′和3′RACE,从中国文昌鱼的消化道中分离得到文昌鱼BjApextrin1和BjApextrin2基因（其DNA序列如序列表中序列1和序列2序列所示）。分别编码504和462个氨基酸（其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所示），等电点分别为6.05和5.03，分子量分别为56,671和52,516道尔顿。