[发明专利]一种海参体表细菌DNA提取方法

权利要求书

1.一种海参体表细菌DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，

（1）海参样品处理：

取鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置-80℃保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，50mL离心管装湿重6~10g的海参体表刨刮物；

（2）海参体表菌体收集：

①向步骤（1）获得的离心管中，加入15~20mL洗脱液Ⅰ，常温下300rpm震荡5~10min，使刨刮下的海参体表粘稠物与洗脱液Ⅰ充分混合；

②4℃下1000rpm离心5~8min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余液体转移到另一无菌离心管中；

③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；

④将步骤③所得液体分装于1.5mL离心管，并于4℃10000rpm离心1~2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；

（3）粘多糖和杂蛋白的脱除：

于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀悬浮，然后55℃孵育震荡1~3h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠；

（4）细菌破壁

上述液体中加入180uL的浓度为20mg/mL溶菌酶，于37℃孵育酶解至少30min，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠；

（5）抽提、纯化：

⑤向步骤（4）获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液Ⅱ，充分混匀后4℃12000rpm离心10~15min；

⑥吸取步骤⑤中上清液500uL，加入洗脱液Ⅱ500uL于1.5mLEppendorf管中，混匀后4℃12000rpm离心10min；

⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入于-20℃预冷的无水乙醇，800uL于1.5mL Eppendorf管中，混匀后-20℃静置20min，4℃下12000rpm离心10min；

⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2~3次，晾干后溶于100uL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20℃条件下贮存。

2.根据权利要求1所述的一种海参体表细菌DNA的提取方法，其特征在于：所述试剂的配制方法如下：

洗脱液Ⅰ：磷酸二氢钾：0.27g，磷酸氢二钠：1.42g，氯化钠：8g，氯化钾：0.2g，加去离子水约700mL充分搅拌溶解，用盐酸调pH至7.4，最后定容到1L；然后加入200mL的CTAB溶液，高温高压灭菌后室温保存；

裂解液：3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β-巯基乙醇和30uL的浓度为50mg/mL蛋白酶K；

CTAB溶液：100mmol/L Tris-Hcl，20mmol/L的EDTA，1.4mol/L的NaCl；

5×TE缓冲液：将Tris 54g，硼酸25g，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，加去离子水定容至1L后，混匀后放4℃保存；

洗脱液Ⅱ：异戊醇：氯仿的体积比为1:24。