[发明专利]一种用于检测对虾五种病毒的引物、液相芯片及其用途

权利要求书

1.一种液相芯片检测引物，其上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，，其中R1与液相芯片的微球连接序列反向互补，R3与待检测序列互补，R2为多聚dT，或寡聚四聚乙二醇，或（CH₂）_n间臂，n≥3；优选R2为（CH₂）_n间臂，n为12或18；更优选R2为（CH₂）_n间臂，n为18；下游引物标记生物素。

2.权利要求1所述的液相芯片检测引物，用于检测对虾一至五种病毒，其引物序列为以下至少一对：检测WSSV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:1，R3为SEQ ID NO:2，下游引物为SEQ ID NO:3，并5’端标记生物素；检测TSV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:4，R3为SEQ ID NO:5，下游引物为SEQ ID NO:6，并5’端标记生物素；检测YHV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:7，R3为SEQ ID NO:8，下游引物为SEQ ID NO:9，并5’端标记生物素；检测IHHNV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:10，R3为SEQ ID NO:11，下游引物为SEQ ID NO:12，并5’端标记生物素；检测IMNV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:13，R3为SEQ ID NO:14，下游引物为SEQ ID NO:15，并5’端标记生物素。

3.一种用于检测对虾一至五种病毒的液相芯片，其特征是，包括：

1）权利要求2的引物；

2）偶联一定核苷酸序列的微球，所述序列选自SEQ ID NO:16-20，并能相应的与1）中引物序列互补配对。

4.一种用于检测对虾一至五种病毒的试剂盒，含有权利要求2的引物和权利要求3的液相芯片。

5.权利要求2的引物，权利要求3的液相芯片，权利要求4的试剂盒用于检测对虾一至五种病毒的用途。

6.权利要求2的引物，权利要求3的液相芯片，权利要求4的试剂盒用于检测对虾一至五种病毒的方法，其步骤为：

样品DNA或RNA提取；

PCR扩增；

与微球杂交；

仪器分析。

7.权利要求6的方法，其步骤为：所述样品DNA或RNA提取中，需要对DNA和RNA进行260nm和280nm的紫外光吸收率的测定，OD260值在0.05～1的区间内，且OD260/OD280比值在1.5～2.0之间。

8.权利要求6的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，采用权利要求1所述的引物进行扩增；PCR的扩增体系如下：2×TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 25μL；上下游引物分别浓度为0.3μmol/L～1.0μmol/L；从对虾中提取病毒RNA并合成的cDNA模板5μL或病毒DNA5μL；补水至50μL；反应条件为95℃变性10min；95℃45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，循环40次；72℃3min。

9.权利要求6的方法，其特征在于：所述与微球杂交为，取1μL权利要求2的微球，加入22.5μL的1.1×杂交缓冲液，混匀；加入2.5μLPCR产物，95℃变性2min，然后42℃孵育30min；加入100μL的用1×杂交缓冲液稀释100倍的streptavidin-R-phycoerythrin，37℃孵育20min所述1.1×的杂交缓冲液为0．11Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，0．22ＭＮａＣｌ和0.088%ＴｒｉｔｏｎＸ－100；所述1×杂交缓冲液为0．1ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，0．2ＭＮａＣｌ和0.08%ＴｒｉｔｏｎＸ－100。

10.权利要求4的方法，其特征在于，所述仪器分析为在Luminex^TM200仪器上读取荧光中位数MF Ｉ值，根据读数进行结果判定；具体的，所述结果判定为：当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值≥3时结果判为阳性，如果其比值＜2时判为阴性，如果2≤比值＜3时结果判为可疑。