[发明专利]德钦野生紫花苜蓿组培繁殖方法

权利要求书

1.德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩叶片消毒后，顺序在愈伤组织诱导、分化、壮苗、生根培养基中进行原球茎愈伤组织诱导、分化、壮苗、生根培养，然后进行试管苗移栽，所述的愈伤组织诱导培养基为MS + 2,4-D 2.0 mg/l+ 6-BA 1.0 mg/l + 3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，分化培养基为MS + 6-BA 0.5 mg/l + NAA 0.5 mg/l + 3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，壮苗培养基为MS+IAA1.0 mg/l +KT0.5 mg/l + 0.8% 琼脂培养基，生根培养基为1/2MS mg/l + 3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂培养基；诱导、分化、壮苗、生根培养的温度为23-25℃，湿度为30-45%，光照强度为1000-3000LX，光照时间为16h/d。

2.如权利要求1所述的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，其特征在于所述的叶片消毒先用自来水冲洗3~5遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H₂O₂溶液浸泡15分钟，无菌蒸馏水清洗5遍。

3.如权利要求1所述的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，其特征在于所述的试管苗移栽是生根组培苗在培养瓶内培养20天后，炼苗5天再移栽于温室大棚，移栽基质为混有灭过菌的营养土即园土:腐殖土:砂土=2:2:1和适量珍珠岩，移栽7天内用塑料薄膜覆盖装有基质的营养盘，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，待组培苗长出健壮的茎叶时移入大田。

4.如权利要求1所述的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，其特征在于选德钦野生紫花苜蓿的叶片为外植体，将幼嫩叶片用自来水冲洗3~5遍，70%酒精浸泡30 s，再用10%H₂O₂溶液浸泡15 min，无菌蒸馏水清洗5遍，然后每一小叶切成5 mm × 5 mm的小块，将切好的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基MS + 2,4-D 2.0 mg/l+ 6-BA 1.0 mg/l + 3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂中，培养条件为温度24℃，光照16h，光照强度1000LX，培养45 d，把经过筛选具有胚性的质地致密或颗粒状或具有绿色芽点，体积适中的愈伤组织块进行分割，使愈伤组织块大小均一，将由同一块愈伤组织块分割得到的小愈伤组织块转入同一分化培养基MS + 6-BA 0.5 mg/l + NAA 0.5 mg/l + 3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂中，进行体细胞胚生长和发育的培养，培养条件为温度24℃，光照强度 3000LX，光照16h，培养45 d；将在分化培养基生成的丛生芽转到壮苗培养基MS+IAA1.0 mg/l +KT0.5 mg/l + 0.8% 琼脂进行壮苗培养基使其快速生长，形成大的丛生苗并伸长，培养10天，将生成2~3cm高的无根小苗在节间下部1mm处切下，移入生根培养基1/2MS+ 3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，培养条件为温度24℃，光照强度 3000LX，光照16h，10d后生根，当试管苗出现3~5条粗根，长2~3cm，苗高5cm以上时移栽，先打开封瓶膜，经3~5d锻炼，移入混有灭过菌的营养土即园土:腐殖土:砂土=2:2:1和适量珍珠岩的培养盘内，最初7天用塑料薄膜覆盖，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。