[发明专利]一种地沟油快速检测试纸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及地沟油检测技术领域，尤其涉及一种地沟油快速检测试纸的制备方法。

背景技术

地沟油也被称为潲水油、泔水油或餐桌回收油脂，是人们对于各种劣质油脂的总称；地沟油经历了多次高温反复油炸与下水道的氧化腐败过程，质量、卫生极差，成分发生变化，产生了如黄曲霉毒素、苯并芘等多种有毒物质，并含有洗涤剂成分等后期污染物，如长期食用必然会引发身体的疾病。轻则引起消化不良、腹泻，严重的会引发贫血、中毒性肝病等症状，长期食用有诱发癌症的危险，危害极大；近年来地沟油事件屡见不鲜据统计，每年有200-300万吨地沟油回流市场，其中大部分并没有用于炼制生物柴油等合法途径，而是回流到餐桌，地沟油占据的食用油市场份额比例高达10%，而且现在的“地沟油”精炼程度已经很高，一些肉眼可见污染物，完全可以通过精炼去掉。

目前，根据地沟油的特征成分，地沟油的检测方法主要有水分含量测定法、酸价测定法、胆固醇含量测定法、近红外光谱法、电导率与极性物质测定法、重金属含量测定法；上述方法在应用上各有优势，一定程度上都能进行地沟油的定性定量检测，但也存在缺陷：如食用油中掺入地沟油的比例普遍需要达到相对较高的程度才能被检出；电导率法的检出下限为地沟油添加量达20%以上，胆固醇法的缺陷在于其检出下限为地沟油的添加量在10%以上，而且在检测中出现假阳性的可能性比较大；薄层层析法对于一些未经纯化油和加入其他成分的油，容易出现假阳性；对于一些检测精度相对于上述方法比较高的，如：深圳药检所，HPLC检测胆固醇含量，最低检测限20μg/ml；深圳药检所，LC-MS法检测DBS( 十二烷基苯磺酸钠)，检出限为20μg/ml；清华大学，顺磁共振波谱法，检测自由基等，需要大型贵重检测仪器，并且耗时较长，更适用于实验室的确证检验而不适于现场快速筛查的使用；上海之江生物医药科技有限公司利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段定性检测地沟油，灵敏度高（可检测出最低1‰的含量），但是整个操作过程繁琐，需要非常专业的人员去操作；广州市疾病预防控制中心利用免疫荧光学检测方法检测细菌脂溶性蛋白和脂多糖，但此法仅能从泔水中含有大量细菌方面对地沟油作出判断；因此，开发新的快速检测技术，用于食用油中地沟油的定性、定量检测迫在眉睫。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种地沟油快速检测试纸的制备方法，包括如下步骤：A）免疫彩色乳胶微球的制备：（a）彩色乳胶微球的预处理：分别取红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用超声波处理后，用超纯水调节浓度，离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到洗好的乳胶，用预冷的MES缓冲液分别将EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳胶中，在室温下缓慢混匀，孵育结束后离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到乳胶微球溶液；（b）抗体标记：用MES缓冲液将鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体、鼠抗苯并芘单克隆抗体、鼠抗茴香胺单克隆抗体和鼠抗DBS单克隆抗体稀释，之后分别缓慢加入到用磁力搅拌器搅拌的红色、黄色、蓝色和绿色的所述乳胶微球溶液中，室温轻柔搅拌后用PBS离心洗涤，沉淀用PBS-TBN溶解，超声波处理后，加入PBS-TBN至标记前体积，置4℃保存备用；B）免疫彩色胶乳反应垫的制备：将玻璃纤维膜浸泡于反应垫处理液中，水浴处理后平铺于纱网上干燥3-4h，将标记后的彩色乳胶微球按照效价实验匹配的结果，以体积比为红：黄：蓝：绿=2：2：4：5混合均匀，按照每毫升乳胶溶液铺50cm²涂覆玻璃纤维膜，干燥16h后置4℃密封保存备用；C）NC膜的制备：将抗原黄曲霉毒素-OVA，苯并芘-OVA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被缓冲液分别稀释至0.3、0.4、0.4和0.2mg/ml，用喷膜仪按1.0、0.8、0.8和1.5μl/cm分别喷涂于同一条NC膜上的不同区域作为检测线，每条检测线相距4-10mm，将浓度为2.0mg/ml的兔抗鼠IgG用喷膜仪按0.5μl/cm喷涂于质控区作为质控线，用封闭液封闭NC反应膜，再用PBST洗脱，然后室温晾干备用；D）彩色胶乳试纸条的的组装：将样品垫放入处理液中处理后干燥备用，将干燥后的样品垫、反应垫、NC反应膜和吸水滤纸按顺序装配在PVC底板上，用带mark胶带绕背板覆盖在样品垫、反应垫及吸水滤纸上，然后用切条机切割成2-10mm宽的试纸条，制成地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条。

利用本发明制备的地沟油检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于现场快速筛选。