[发明专利]一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法

说明书

  

技术领域

本发明属于植物植物基因工程技术领域，具体是一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，主要是针对烟草黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、烟草马铃薯Y病毒（Potato Y virus, PVY）、烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus, TMV）和烟草马铃薯X病毒病（Potato virus X, PVX）的RNA干涉载体构建方法、及其在烟草上应用。 

  

背景技术

病毒病是烟草生产中不可忽视的病害，是造成烟草生产损失的重要原因。我国主要病毒病种类有TMV、CMV、PVY、PVX和烟草蚀纹病（Tobacco etch virus, TEV）等。20世纪60年代以前，全国烟区都以TMV危害最重；70年代以后，在黄淮烟区尤其是山东的CMV危害迅速上升，1974-1977年以CMV为主及CMV与TMV复合侵染，连续3年大流行，而在南方烟区和北方烟区仍以TMV为主要病害；20世纪80年代以后，不仅CMV在中、南部烟区危害继续上升，各类病毒病交替或同时流行危害，PVY开始发现，并逐年加重，已成为又一个主要病毒病害，与CMV、TMV混合发生、复合侵染。据统计，2008年我国病毒病造成的烟叶产值损失占病虫害总损失的23.4%。病毒侵染烟草后造成的花叶、坏死等症状对烟叶质量产生重大损害。 

针对烟草病毒病发生的日趋严重，人们采用各种手段对其进行防治。然而，抗病品种的选育存在着培育时间长、容易出现抗性丧失等问题；农业措施往往只能减少或预防病毒初侵染源；化学药剂方面，目前还没有很好的方法能治疗烟草病毒病，主要也是以防治病毒传播介体为主要手段，化学农药存在着防效低、在作物上的残留多、对人畜有害及对环境造成污染等，目前用于防治病毒病害的农药制剂虽多，但是真正的有效成分和剂型很有限；生物防治方面在生产上的真正应用还很少。各种实践经验以及研究表明，通过育种或抗病毒基因工程方法使植物体本身具备病毒抗性是防治病毒最为有效的方法。 

近年来，RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术在抗病毒研究中倍受关注，RNAi是一种基因沉默新技术，即人为地将与病毒基因同源的双链RNA导入寄主，引起与其同源的病毒基因发生沉默，从而达到抑制病毒复制的目的。对动植物而言，RNA干扰是植物调控内源基因表达和防御外源核酸入侵的重要机制。 

  

发明内容

本发明以我国四种主要烟草病毒（TMV、CMV、PVY和PVX）为对象，利用植物基因工程技术将人为构建的包含四种病毒序列的发夹状结构转入烟草中，使烟草转录出的发夹状双链RNA结构在植物自身机制下剪切成小RNA（siRNA），特异性地干扰、降解或沉默靶标病毒基因在烟草植株体内的正常复制和积累，筛选获得抗多种烟草病毒的烟草新材料，为利用RNAi介导的烟草抗病毒烟草育种工作提供了经验和实例。 

基于上述目的，本发明提供了一种可供农杆菌遗传转化烟草、针对多种烟草病毒的RNAi载体构建方法，该载体包含致病病毒CMV的RNA2-2B基因、PVY的HC-Pro基因、PVX的CP基因和TMV的CP基因部分保守核苷酸序列，以及利用该载体遗传转化烟草获得抗病毒烟草。该技术方法的建立将为烟草抗病毒育种工作提供一种新的策略和思路。 

本发明目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，连接成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株，经检测得到转化成功的植株。

具体步骤如下： 

1）嵌合基因的设计与合成

通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，筛选4种病毒基因组范围内的多个相对保守区域，针对CMV的2B、PVY的HC-PRO、TMV和PVX的 CP基因（编码外壳蛋白coat protein）区域各筛选确定200bp片段。4段序列连接成总共800 bp的序列，排列顺序为TMV-PVX-CMV-PVY，人工合成全长嵌合基因。

 2）RNAi载体构建

（1）内含子的选取