[发明专利]一种评价防治骨质疏松药物作用的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种模式生物评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法。

背景技术

活性筛选一直是药物发现的关键环节，也是中药物质基础、作用机理、质量控制、炮制机理、配伍规律等关键领域的不可或缺手段，活性筛选新模型、新方法的研究是中药研究的重要组成部分。

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类疾病，由于西药长期应用副作用大等缺陷，中药治疗骨质疏松的功效正日益受到重视。但壮骨中药及其成分特别是微量成分的活性评价却不能高效进行，主要存在2个瓶颈问题：一是评价模型问题：现有动物壮骨模型耗时长，用样量大，劳动强度大，使得活性筛选效率低；现有细胞模型成本高，试验条件要求较高，原代培养难度增加，一般的实验室不能进行，此外，体外细胞模型作用环节相对单一，不能体现在体试验的综合效果；二是化合物的数量问题：由于中药成分复杂，很难分离到能满足体内研究的足量化合物，大量的微量成分只能通过细胞模型进行筛选。可见，现有模型难以实现对中药及其成分壮骨活性的高效、灵敏、高通量的筛选。

模式生物是指在人们研究生命现象过程中长期、反复作为研究材料的物种，从这个物种研究中得出的许多生命活动规律往往代表了许多物种共同的规律。其中斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模饲养繁殖。成体鱼长3～4cm，养殖成本仅为养小鼠的0.1%-1%。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%，所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol, 4, 504-12 (2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S. Sumanas and S. Lin, DDT: TARGETS, 3, 89-96 (2004)]。如中国专利200810019040.5公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法，CN101810866A公开了一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的方法，200310108710.8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病，201010258459.3公开了一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法。斑马鱼与哺乳动物骨骼生长发育的分子机理极为相似，而且近年来越来越多的调节哺乳动物骨骼发育关键基因的同源基因在斑马鱼基因组中被发现。和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从三种胚胎干细胞系发育而来，已有研究表明斑马鱼幼鱼骨包含骨形成和骨吸收活动所需的细胞，是较完整体系。骨骼形成机制也包括软骨内骨化和膜内骨化，其过程都受到包括一系列转录因子和激素在内的复杂机制的严格调控，参与调控的关键基因，如runx2, osteonectin, osteoprogenin等与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性。哺乳动物与斑马鱼头部骨骼生成所涉及到的转录因子具有极其相似的表达机制和调控方式[Li N, Felber K, Elks P, Croucher P and Roehl HH. Dev Dyn, 238 (2), 459-466(2009)]。斑马鱼具有与哺乳动物相似的调节骨骼发育的关键基因，具有与哺乳动物相似的骨骼形成机制，以及与哺乳动物相似的系统、酶系及基因，为研究人类许多常见疾病的发病机制提供了理想的实验模型，同时也为药物的作用机制、安全性评价及代谢研究提供了理想的实验模型。因此可将它作为具有完整骨骼体系的理想模式生物用于药物对骨骼的作用研究。国内在这方面的研究尚属空白。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的模式生物斑马鱼模型来快速评价防治骨质疏松的药物作用效果。

本发明的思路为：利用茜素红作为染色剂给斑马鱼加以染色并可反映出机体内骨矿化量和骨密度的机理为：茜素红与钙离子形成螯合物，使矿化的骨基质染成红色；再用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行检验；从而可以利用本方法来观察和评估防治骨质疏松药物作用的效果。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

本发明这种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，它包括以下步骤：