[发明专利]丹参内生真菌菌丝水溶性提取物及其部位的制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种丹参内生真菌菌丝的水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位，此外，本发明还涉及该丹参内生真菌菌丝水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位的用途，用于促进丹参毛状根生长和提高丹参酮类成分含量。

背景技术

丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）是唇形科鼠尾草属植物，其干燥根及根茎同名入药，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用传统中药，味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。临床广泛用于心脑血管疾患，是国内外现代化中药研究的热点品种之一。现代研究表明，丹参的化学成分主要分为两大类：一是以丹参素为基本结构的水溶性成分——酚酸类化合物，包括原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等；二是脂溶性成份——二萜类化合物，包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、ⅡB、隐丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ等。临床研究证实，丹参含有的多种化学成分具有广泛的生物活性，其传统药理以扩血管，活血化瘀，改善微循环为主。现代药理研究表明，丹参尚具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗雄性激素，抑制皮脂腺增生，抗肝硬化，抗纤维化，促进组织修复和再生等多种药理活性。丹参的市场需求大，而野生资源日益减少，栽培品种退化严重。人工引种栽培存在引种困难和栽培环境制约等客观因素的影响，活性次生代谢成分的含量不稳定，药材质量得不到保证。

利用生物技术手段获得丹参有效化学成分相继成为研究热点，丹参毛状根培养技术就是其中之一。它利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes侵染宿主受伤部位细胞并产生大量转化不定根，又称毛状根。与传统的细胞培养技术相比，毛状根具有生长迅速、遗传性状稳定及激素自养型等特点。目前丹参毛状根培养技术已相当成熟，但有效成分含量较低大大制约了毛状根的应用。采用生物与非生物诱导子进行刺激，能够有效地促进丹参毛状根的生长和提高丹参毛状根中次生代谢产物的含量。

发明内容

根据本发明的实施例，希望利用植物内生真菌资源，采用生物与非生物诱导子进行刺激，能够有效地促进丹参毛状根的生长和提高丹参毛状根中次生代谢产物的含量，并提供一种丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)、丹参内生真菌菌丝多糖蛋白部位(PPF)和丹参内生真菌菌丝多糖部位(PSF)，进而提供丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)、丹参内生真菌菌丝多糖蛋白部位(PPF)、丹参内生真菌菌丝多糖部位(PSF)在丹参毛状根中提高丹参酮类成分含量的应用，为新型诱导子的开发和探讨内生真菌与宿主之间的相互关系提供依据。

本发明涉及的丹参内生真菌和中国专利CN102676392A公开的丹参内生真菌相同，它的命名为深绿木霉Trichoderma atroviride，菌株代号为D16，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.4712。

1.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)的制备。

收集发酵培养9-14天的丹参内生真菌菌丝体，加入适量蒸馏水重悬，高压锅110-130℃灭菌30-60min。待自然冷却，减压抽滤后得到的滤液，即为丹参内生真菌水溶性提取物。采用硫酸-苯酚法测定总糖浓度。

2.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制备。

减压浓缩丹参内生真菌水溶性提取物WSE至适当体积，加入4-7倍体积70-95%的乙醇2-8℃静置24-72小时，以2000-10000转/分的转速离心分离10-15分钟得白色沉淀，无水乙醇洗3-5次后收集沉淀，真空冷冻干燥所得白色粉末即为丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位PPF。

3.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位(PSF)的制备。

将丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位PPF重新溶于适量蒸馏水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍体积的70-95%的乙醇2-8℃静置24-72小时，以2000-10000转/分的转速离心分离10-15分钟得白色沉淀，无水乙醇洗3-5次后收集沉淀。将沉淀用适量蒸馏水溶解，室温在蒸馏水中透析24-72h（截留分子量为1000-10000Da），然后以2000-10000转/分的转速离心分离得到上清液，真空冷冻干燥所得白色粉末即为丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位PSF。

4.丹参毛状根悬浮培养特征。