[发明专利]人外周血淋巴细胞所受电离辐射剂量的一种检测方法

说明书

技术领域

本发明属于辐射生物剂量估算领域，具体涉及人外周血淋巴细胞所受电离辐射剂量的检测方法。

背景技术

电离辐射对机体的损伤是通过原发作用的直接和间接作用，引起生物分子结构和性质的变化，由分子水平的损伤进一步造成了细胞水平、器官水平和整体水平的损伤，出现相应生化代谢紊乱并由此产生一系列表现或造成死亡和产生某些远后效应。

在核战争和核或放射事故中，大量受照人群的分选和急救是抢救可治愈人群(10Gy以下)的关键，而成功的救助需要快速、准确的估算受照剂量。目前估算剂量的方法很多，包括物理的和生物的方法。生物学方法具有其优越性，辐射生物剂量计在核事故受害者受照剂量估算及辐射生物学效应研究中具有重要的应用价值。理想的电离辐射生物剂量计应具备的特点包括：①具有电离辐射可诱导性，特异良好的量-效关系；②确定的剂量和时间响应范围；③遗传背景稳定，本底变异较低；④影响、干扰因素明确且可控制；⑤采样方便，分析方法简单、迅速、可靠，易于自动化大通量操作；⑥经济成本和社会成本低等特点。

目前常用的生物剂量计有早熟凝聚染色体片段分析、微核分析、稳定染色体畸变分析、体细胞基因位点突变分析等。但这些技术相对复杂，需要良好的专业知识和训练后才能够顺利开展，而且在大量人群受到照射的情况下不能满足高通量检测、生物辐射剂量快速定量检测的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速定量、高通量估算人外周血淋巴细胞所受电离辐射剂量的检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

人外周血淋巴细胞所受电离辐射剂量的一种检测方法，包括如下步骤：

(1)、根据淋巴细胞gdf15基因表达序列设计引物和Taqman-MGB探针，构建含有淋巴细胞gdf15基因表达序列的重组载体作为标准物质；

(2)、以步骤(1)所述引物和Taqman-MGB探针对10倍系列稀释的标准物质进行实时荧光PCR，绘制绝对定量标准曲线；

(3)、将正常人外周血中分离的淋巴细胞分组接受不同剂量的电离辐射，按照步骤(2)所述实时荧光PCR的方法对辐射后不同培养时间淋巴细胞gdf15基因的表达水平定量测定，获得辐射剂量和gdf15基因表达水平的拟合剂量效应曲线；

(4)、按照步骤(2)所述实时荧光PCR的方法对待测辐射剂量的人外周血淋巴细胞gdf15基因的表达水平定量测定，根据步骤(3)所述的拟合剂量效应曲线计算待测淋巴细胞所受的电离辐射剂量。

上述技术方案中，步骤(1)所述的淋巴细胞gdf15基因表达序列如SEQ ID NO：1；所述引物的上游引物如SEQ ID NO：2，下游引物如SEQ IDNO：3；Taqman-MGB探针序列如SEQ ID NO：4，探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ。

本发明提供的人外周血淋巴细胞所受电离辐射剂量的检测方法，是根据人外周血淋巴细胞gdf15基因表达序列设计引物及TaqMan-MGB探针，以构建的含有淋巴细胞gdf15基因表达序列的重组载体10倍系列稀释作为标准品模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，绘制标准曲线，斜率为-3.5345，相关系数R2＝0.999，呈现很好的线性关系，扩增效率为99.7％。灵敏度检测结果表明，PCR反应31个循环时可以检测到的质粒最小浓度是50拷贝数/μL，选用50、500、5000、50000和500000拷贝数/μL5个浓度梯度质粒做模板，变异系数在1.2％-3.2％范围内，说明该方法具有良好的重复性和稳定性。本发明通过优化TaqMan-MGB探针荧光定量PCR反应条件和反应体系，能够快速定量检测人外周血淋巴细胞gdf15基因在接受电离辐射时的表达水平变化，与现有的辐射后早熟凝聚染色体片段分析、微核分析、稳定染色体畸变分析、体细胞基因位点突变分析等方法相比，可以大大的节省时间，达到简便，快速定量，高通量的要求，在遇到大规模辐照事故时，可以凸显其优势。

附图说明

图1为标准物质重组pUC57质粒的构建示意图。

图2为标准物质重组pUC57质粒琼脂凝胶电泳图。

图3为10倍系列稀释的标准物质绘制的标准曲线。横坐标表示基因拷贝数的对数值，纵坐标表示Ct值。

图4为辐射后淋巴细胞培养4、8、12、24和48小时的拟合剂量效应曲线。

具体实施方式