[发明专利]TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表达载体及制备

权利要求书

1.TELKP融合免疫毒素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的TELKP融合免疫毒素，其特征在于：氨基酸序列从N端至C端依次为Trx标签、EK识别序列、Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列、uPA识别序列。

3.LKP融合免疫毒素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的LKP融合免疫毒素，其特征在于：氨基酸序列从N端至C端依次为Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列、uPA识别序列。

5.含权利要求4所述LKP融合免疫毒素的基因的重组表达载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs，其特征在于，包括pET-32a（+）载体序列和LKP融合免疫毒素的基因序列。

6.权利要求5所述表达载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采用RT-PCR法，以植物丝瓜籽总RNA为模板，以上游SEQ ID NO3和下游SEQ ID NO4为引物对，扩增得到PCR产物I，即为Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入载体pTA2中得到阳性重组载体pTA2/Luffin-β，

SEQ ID NO3：5’-ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，

SEQ ID NO4：5’-GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’；

（2）采用引物延伸法，以所述载体pTA2/Luffin-β为模板，以上游SEQ IDNO5和下游SEQ ID NO6为引物对，扩增得到PCR产物II，即为包括Luffin-β肽段、KDEL驻留信号序列和uPA识别序列的cDNA序列，再用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切所述PCR产物II和pET-32a（+）载体，分别回收含Luffin-β-KDEL-uPAcs的cDNA序列片段和pET-32a（+）骨架片段，纯化后连接，得阳性载体pET-32a（+）/Luffin-β-KDEL-uPAcs，SEQ ID NO5：5’-CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID NO6：5’-CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3’。

7.权利要求1或2所述TELKP融合免疫毒素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将所述表达载体pET-32a（+）/Luffun-β-KDEL-uPAcs转化表达菌BL21(DE3)；

（2）挑取克隆转种于含50μg/ml Amp的LB培养基中，37℃，220r/min振摇培养至对数生长期，加入0.4mmol/L IPTG，于30℃过夜诱导使其表达TELKP融合免疫毒素；

（3）于4℃，6000r/min离心15min收集菌体，弃上清液，加入10倍体积的pH7.3的PBS溶液重悬菌体，再加入PMSF和DTT，超声破碎菌体，破菌完全后于4℃，10000r/min离心15min，将上清以0.45μm微孔滤膜过滤，再上样于金属螯合Ni²⁺柱，最后以Elution Buffer洗脱得到TELKP融合免疫毒素溶液。

8.权利要求3或4所述LKP融合免疫毒素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）向所述TELKP融合免疫毒素溶液加入EK酶过夜酶切；

（2）酶切后的蛋白用阳离子交换柱Pharmacia HiTrap SP Fast Flow column(26/20)洗脱纯化得LKP融合免疫毒素溶液。