[发明专利]2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺

说明书

技术领域

    本发明涉及维生素C的制备方法，具体地说是一种2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺。 

技术背景

目前，我国的维生素C生产厂家均采用二步发酵生产技术。其主要特点是二步发酵过程由两种菌混合培养完成的。其中普通生酮基古龙酸菌将山梨糖转化为2-KLG，普通生酮基古龙酸菌俗称小菌，是产酸菌，另一种菌为巨大芽孢杆菌，促进小菌生长与产酸，巨大芽孢杆菌俗称大菌，是伴生菌。两种菌共同作用，将山梨糖转化为2-KLG。公知的2-KLG发酵的菌种制作技术中：从保藏菌种活化，到种液扩大培养和发酵过程中，大、小菌一直是混合搭配使用。采用混合菌发酵，由于是两种菌种同时培养，大菌生长过程中产生的酶一方面对小菌有促进作用，另一方面，其本身的生长和代谢也会对小菌生长造成拮抗作用。同时，由于是混合培养，对小菌的遗传改良、筛选和保藏极为不便，也不利于对菌种培养和发酵过程的无菌度管理。 

发明内容

本发明的目的是提供一种2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，可以避免原工艺中大、小菌混合培养、发酵时巨大芽孢杆菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长代谢过程的管理，缩短发酵周期。 

本发明是这样实现的：2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，其特征在于：在菌种制备和发酵过程中，将巨大芽孢杆菌、普通生酮基古龙酸菌分开培养，先将巨大芽孢杆菌在液体培养基中培养至终点后，制成细胞裂解液，备用；再将单独保藏的普通生酮基古龙酸菌活化培养，分离筛选，继续接种到斜面和种液扩大培养，然后接入发酵培养基中发酵。将巨大芽孢杆菌裂解液按3~30%接种量分别加入普通生酮基古龙酸菌各级培养物中，促进普通生酮基古龙酸菌的正常生长代谢。本发明可以避免原工艺中大、小菌混合培养、发酵时大菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长代谢过程的管理，缩短发酵周期。 

具体实施方式

 2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，其特征在于：在菌种制备和发酵过程中，将巨大芽孢杆菌、普通生酮基古龙酸菌分开培养，先将巨大芽孢杆菌在液体培养基中培养至终点后，制成细胞裂解液，备用；再将单独保藏的普通生酮基古龙酸菌活化培养，分离筛选，继续接种到斜面和种液扩大培养，然后接入发酵培养基中发酵。将巨大芽孢杆菌裂解液按3~30%接种量分别加入普通生酮基古龙酸菌各级培养物中，促进普通生酮基古龙酸菌的正常生长代谢。具体实施时，本发明可以避免原工艺中大、小菌混合培养时大菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长发酵过程的管理，消除了发酵过程中大菌生长时间，缩短发酵周期。新工艺保留原工艺主要过程，只需要对大菌培养液进行裂解处理，即可实现小菌的单独培养和发酵，不需要增添新设备，亦不需要改造原设备，菌种不变，操作简便，易广泛应用。 

 下面通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 

实施例1 

先将小菌单独接种到装量70ml的茄瓶斜面培养基中，同时加入5ml大菌裂解液，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面用冷冻真空干燥法制作冷冻管保藏，纯小菌冷冻管低温保藏2年后，存活率达85%以上。

将保藏的小菌冷冻管通过液体种子培养基活化培养40小时后，将活化种液稀释至10^-7，涂布接种至分离平皿上，培养72小时，生成单个小菌菌落，挑选出若干优良小菌，接种至装量70ml的茄瓶斜面培养基中，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面接种到液体种子培养基中，培养24小时，得到纯小菌培养液。在以上各级小菌培养物中分别按5%接种量加入大菌裂解液。 

将培养好的小菌培养液10ml，接入到80ml发酵培养基中，另加入5ml大菌裂解液，发酵摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量77.36mg/ml，发酵周期54小时，较混合菌种发酵缩短6小时。 

实施例2 

先将小菌单独接种到装量70ml的茄瓶斜面培养基中，同时加入5ml大菌裂解液，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面用冷冻真空干燥法制作冷冻管保藏，纯小菌冷冻管低温保藏2年后，存活率达85%以上。