[发明专利]一种建立芦竹组培体系的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种建立芦竹组培体系的方法。

背景技术

植物组织培养是在细胞全能性理论基础上建立起来的一种技术。近年来，植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，显示出巨大的应用潜力，被广泛应用于植物学、遗传学、育种学等各个领域。我国当前经济高速发展，在能源和污染方面面临着比较大的挑战。芦竹被认为是一种草本能源植物，兼具有污染修复特性。芦竹对Cu²⁺、pb²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr⁶⁺等重金属都具有一定的耐性,被用作修复镉汞等重金属污染湿地。研究表明芦竹修复体系对污染土壤中As，Cd，Pb和Zn有一定的稳定和去除作用。但是，包括芦竹在内的污染修复植物都存在一定的局限性。如何提高污染修复及利用效率是需要解决的一个关键问题。研究者采用改良剂等方法对 As, Cd, Pb 污染土壤上芦竹生长及重金属吸收的相关性进行了研究，来提高芦竹污染修复性能。但是，效果有限。基因工程作为一种现代生物技术是改造芦竹成为一种超级污染修复和能源植物中的关键技术。其中，高效的组培体系是基因工程的必备条件。Miguel 2012年报道了芦竹组织培养的研究，但是在外植体取材及繁殖方式上，很难用作遗传转化。冉隆贤等 1998年也曾对芦竹组培进行了报道，但是在一个培养周期内，一个茎段只产生一个嫩芽。对于芦竹的研究和应用，迫切需要在外植体取材、高繁殖效率、高的移栽成活率等方面做深入研究，建立适合基因工程的组培体系。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，对芦竹组培过程中各个环节进行研究，拟建立一种芦竹组培体系的方法，实现芦竹的高效繁殖。

本发明解决所述技术问题的方案是：一种建立芦竹组培体系的方法，包括如下步骤，

（1）外植体消毒

取芦竹的腋芽作为外植体，移入超净台中，在75 %乙醇中完全浸没10秒后立即移入0.2 %的升汞溶液中10分钟，之后用无菌水冲洗；

（2）初代培养

在无菌条件下，剥取2～3毫米带顶端生长点的组织，插入培养基中，培养基为：MS中添加蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，再加入6-BA 5 mg/L 和 IBA 0.5 mg/L，最后调节pH至5.8；培养温度为：25 ± 1 ℃ ，光照强度为：2500 Lx，光周期为：16小时光照8小时黑暗；

（3）继代培养

将初代培养得到的芽在无菌条件下剥取2～3 毫米带顶端生长点的组织，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的培养基和培养条件与初代培养的培养基和培养条件相同；

（4）壮芽及生根培养

将继代培养得到的芽在继代培养基中延长培养1个月完成壮芽，之后在无菌条件下将完成壮芽步骤的芽分成单个芽，切掉基部褐色组织，接种到生根培养基中，生根培养基为：MS中添加IBA 0.5 mg/L；

（5）驯化移栽

取出生根后的植株，将其转移到打孔泡沫板的孔中，打孔泡沫板漂浮于水面上，进行一周时间的驯化，驯化后移栽。

作为进一步的技术方案，所述步骤（1）中作为外植体的腋芽的高度为4～6毫米。

作为进一步的技术方案，所述步骤（1）中取芦竹的腋芽作为外植体的操作在7～9月进行。

作为再进一步的技术方案，所述步骤（5）中移栽的操作流程为：取底部有孔的盆，盆中装填草炭土，盆中种植植株后放置于水位高为3厘米的常温自来水中，使草炭土充分吸水后置于常温环境中，植株在盆中生长2个月后可再移栽于温室或大田。

本发明的有益效果有：

（1）本发明研究了芦竹腋芽的最佳消毒法，与其他植物相比，芦竹外植体消毒这一环节较为困难，很难达到理想的灭菌效果，采用本发明的技术方案，初代培养时芽的污染率在10%以下，死亡率在20%以下。

（2）本发明研究了芦竹腋芽在初代培养、继代培养过程中最佳激素组分及含量的配比，采用本发明的技术方案，腋芽分化的幼苗粗壮、生长快，每个芽初代培养可诱导5个芽以上，继代培养可诱导出15个芽以上。

（3）本发明研究了芦竹腋芽在生根培养过程中最佳激素组分及含量的配比，采用本发明的技术方案，生根率100%，经过一个月的生根培养，根的长度为4.0厘米以上。