[发明专利]游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法

权利要求书

1.游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法,其特征在于:用大孔吸附树脂对对苯二酚进行固定化，然后用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞在缓冲溶液系统中催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷，该方法由下列工艺步骤组成：

（1）固定化对苯二酚的制备；

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备，其中包括种子培养和发酵罐培养；

（3）加入固定化对苯二酚和双糖进行合成反应；

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用；

（5）α-熊果苷的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（1）步骤中固定化对苯二酚的制备是利用大孔吸附树脂吸附法制备，其步骤是：先配制质量百分比浓度为1-10％的对苯二酚水溶液；然后每100mL对苯二酚水溶液加入10g大孔吸附树脂进行吸附，待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为0.1-1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。

3.根据权利要求1或2所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的用于固定化对苯二酚的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂。

4.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（2）步骤中的种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成：双糖10-60份，蛋白胨1-10份，酵母粉1-10份，硫酸镁0.5-2份，磷酸氢二钾1-3份，氯化钠1-3份和水1000份。

5.根据权利要求1或4所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：种子液培养的工艺条件为培养温度为25-40℃，摇床转速为50-200r/min，发酵时间为10-24h；发酵液培养的工艺条件为种子液接种量为1-10％，培养温度为25-40℃，通风量为0.1-2vvm，搅拌转速为50-300r/min，发酵时间为10-24h；把培养后的发酵液进行微滤或离心即可获得菌体游离细胞。

6.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（3）步骤中的反应条件为：在一定体积的缓冲溶液中，游离细胞质量百分比浓度为5-20g/L，固定化了对苯二酚的大孔吸附树脂质量百分比浓度为10-100g/L，双糖的质量百分比浓度为5-720g/L，反应温度为20-50℃，搅拌转速为50-300r/min，反应时间为24-72h。

7.根据权利要求1或6所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液，柠檬酸缓冲溶液，碳酸缓冲溶液，硼酸缓冲溶液，巴比妥酸缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。

8.根据权利要求1或6所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的双糖为蔗糖，麦芽糖或乳糖。

9.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（4）步骤中的游离细胞的使用寿命为5-10个周期，固定化对苯二酚的大孔吸附树脂的使用寿命为50-300个周期。

10.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（5）步骤中的α-熊果苷的分离纯化包括以下三个步骤：

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净；

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液；

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为2-12h。