[发明专利]一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物及检测方法

权利要求书

1.一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物，其特征在于所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.一种应用于检测家蚕质型多角体病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物。

3.一种利用权利要求1所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）试剂盒抽提家蚕质型多角体病毒RNA；

（2）试剂盒对所提RNA采用Random Primer引物进行反转录；

（3）应用所述引物对反转录样本进行PCR扩增；

（4）取步骤（3）PCR扩增产物用1％的琼脂糖电泳检测。

4.根据权利要求3所述利用权利要求1所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，其特征在于步骤为：

1)病毒多角体悬浊液200μL，转入1.5mL离心管，加入400μL裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混匀；

2）室温放置10min，每隔5min，振荡混匀一次；

3）加入450μL无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；

4）将上述混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液；

5）加500μL去蛋白液RE，12000rpm离心30s，弃废液；

6）加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃废液，重复一遍；

7）将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液RW；

8）取出吸附柱RA，放入一个RNase free的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μL65-70℃RNase free H₂O，室温放置1min，12000rpm离心1min；

9）同步骤1～8抽提家蚕中肠总RNA；

10）反转录合成第一链cDNA：100ng/μL Total RNA，1μL；0.1μg/μL Random Primer，1μL；10mM dNTP Mixture，1μL；5×RT Buffer，4μL；40units/ul Rnase Inhibitor，0.5μL；TUREscript H^-Rtase，1μL；RNase free H₂O，11.5μL；混匀25℃孵育10min，42℃孵育50min；然后70℃孵育5min；

11）PCR扩增：总体积25μL：2.5μL 10×PCR Buffer，1μLdNTPs；正反向引物浓度为10μM，各加0.5μL；1μLcDNA；19μLddH₂O；2.5U/μLTaq酶，0.5μL；反应条件为，94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，30个循环；72℃10min；

12）取上步PCR扩增产物用1％的琼脂糖电泳检测在370bp处是否有清晰的条带。