[发明专利]多角体基因前120bp片段及其应用

说明书

技术领域

 本发明涉及对一种多角体基因前120bp片段及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

大肠杆菌表达系统目前是应用最广泛的蛋白表达系统之一，其具有成本低廉、生产率高、操作简单等优点。该系统主要有表达载体、表达宿主菌、表达条件等组成。目前，越来越多的研究人员关注于融合表达载体的应用，研究成功的融合表达载体主要有：GST (谷光甘肽-S-转移酶) 系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白(MBP) 系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。

家蚕(Bombyx mori)多角体蛋白(Polyhedrin，Polh)基因共有738个核苷酸，编码由245个氨基酸组成的大小为29 kD的多肽。它是多角体的主要结构成份；多角体蛋白构成的蛋白质晶体对包埋在其中的病毒体具有保护作用，它使病毒体在自然环境中保持稳定和侵染能力。多角体蛋白基因polh是一个超表达极晚期基因。在病毒感染的晚期，当其它病毒基因和宿主基因关闭后，此基因能持续高水平表达，在受感染细胞内产生的多角体蛋白的量可达细胞蛋白质总量的25％-50％。近20年来，人们都致力于研究多角体蛋白基因的高效表达机制，并且利用它的这种特性使许多外源基因得到了高效表达，尤其是一些难以表达的蛋白例如膜蛋白。家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白具有它独特的性质，在大肠杆菌中表达的多角体蛋白在中性pH条件下以包涵体的形式存在，只有在碱性条件(pH 10.8及以上)下可溶，并且这种多角体蛋白具有与天然多角体蛋白晶体相同的性质。因此，可将目的蛋白基因与其融合表达，一方面能提高目的蛋白的表达量，另一方面，通过简单的pH梯度洗脱和差速离心的方法就可以获得较纯的融合蛋白，再经过特异性蛋白酶酶切消化，回收得到较纯的目的蛋白。张耀洲等在纯化标签融合系统上进行改造，将具有高效表达的能力多角体蛋白作为一种标签，将不表达或者难表达的蛋白基因融合上去，从而使其表达或者提高其表达量。同时，利用多角体的溶解特性，通过简单的pH调节和差速离心的方法得到比较纯的融合蛋白，之后进行蛋白酶切得到纯的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用pH范围在7.0-8.5，而多角体蛋白只有在pH10.8时才会溶解，所以在这一条件下进行酶切时，蛋白酶丧失活性或者无法达到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多角体基因前120bp片段及其应用。本发明通过在常用载体的基础上，插入该多角体蛋白基因前120bp片段，后面可继续克隆上外源基因，用于融合表达；表达出来的融合蛋白，可用调节PH值的方法等进行快速纯化该目的蛋白，还能在低pH值(pH7.6)下溶解，所溶解的pH值符合一般蛋白酶反应需要的条件。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种多角体基因前120bp片段，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供上述多角体基因前120bp片段在表达融合蛋白及降低其溶解性中的应用。

本发明还提供上述多角体基因前120bp片段与蛋白酶酶切位点连接而成的重组基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，其中所述蛋白酶为凝血酶。

本发明还提供一种含上述多角体基因前120bp片段的重组载体。

进一步地，其中所述重组载体由多角体基因前120bp片段与转移载体构建而成。

进一步地，其中所述转移载体为 pET22b、pET28a、pET28b、pET28c、pET32a、pcDNA3或pFastBac ^TM。

进一步地，其中所述转移载体为pET28a。

本发明进一步提供一种含上述多角体基因前120bp片段的基因工程菌。

进一步地，其中所述基因工程菌为大肠杆菌。

本发明主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前120bp片段(polh120)和外源基因EGFP进行融合表达，同时与全长多角体融合方式比对。本发明中的融合方式在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的pH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。

 

附图说明

图1是本发明构建的重组表达载体的质粒图；

图2是本发明多角体基因前120bp片段的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量标准；1：目的基因PCR产物；