[发明专利]一种Vc二步发酵菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及菌株筛选方法，具体的说是一种Vc二步发酵菌株的筛选方法

背景技术

Vc二步发酵的工业化生产，其第二步发酵为两种菌的混合发酵，实现从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的生物转化。两种菌包括具有产酸能力的细菌-普通生酮基古龙酸菌（俗称产酸菌或小菌）和不具有转化能力但却能促进小菌生长和产酸的伴生菌（俗称大菌）。

菌种选育是提高Vc二步发酵效率的重要途径。

传统方法均需首先对待筛选小菌和大菌进行搭配，之后再进行试管或摇瓶发酵培养，最后通过测定古龙酸含量来确定小菌产酸能力的优劣。小菌与大菌间的搭配极难控制，因其涉及到小菌数量、大菌数量和培养条件等多重因素的影响，因此各待筛选菌与大菌的搭配比例难以达到最佳，导致以测古龙酸产量为指标的筛选结果并不能真正体现小菌的产酸能力。可见，传统的筛选方法不仅工作量大，而且筛选方法准确度低，导致小菌筛选效率低下。建立一种高效、简便的小菌筛选方法是提高小菌筛选效率的关键。

发明内容

本发明目的在于提供一种Vc二步发酵菌株的筛选方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种Vc二步发酵菌株的筛选方法，将Vc二步发酵中的转化菌和伴生菌混合培养于Vc二步发酵的种子液中，发酵液经离心后，所获上清液为转化菌溶液A；另将Vc二步发酵中的伴生菌接种于培养基中培养20-28小时，培养后经无菌滤膜过滤滤液为发酵液B；将转化菌溶液A与发酵液B按2：1～8：1（v/v）混匀,而后进行稀释，取稀释液涂布于分离培养基上，在29-37℃培养4-8天后，形成转化菌的菌落；再在形成转化菌的菌落的分离培养基上加入0.1％浓度的无菌溴百里香酚兰指示液，于常温下静置0.5～2小时，根据菌落周围的黄色圈大小判断转化效率高低，从而快速筛选出具高效转化能力的转化菌株。

所述混合菌由转化菌和伴生菌构成；转化菌为生酮基古龙酸菌，伴生菌为蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌中的一种；混合菌培养于Vc二步发酵的种子液中伴生菌的数量为3.0-6.0×10⁸个/ml，转化菌与伴生菌的数量比在15:1左右为宜。

将Vc二步发酵中的伴生菌以15％（m/v）的接种量于培养基中培养20-28小时，培养液用孔径0.22μm滤膜过滤除菌，所获滤液为发酵液B。

所述分离培养基按重量百分比计蛋白胨0.3％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％，MgSO₄ 0.01％，FeSO₄ 0.01％,L-山梨糖2％，pH 7.0,琼脂2.5％，余量为水；121℃高温灭菌20min；待用。

将上述生长了转化菌菌落的分离培养基用0.1％浓度的无菌溴百里香酚兰指示液覆盖，随后于常温下静置0.5～2小时，分离培养基上菌落周围形成浅黄色圈，黄色圈大者为转化效率高的菌株。

比较各菌落周围浅黄色圈的大小，若浅黄色圈较大（当浅黄色圈直径与菌落直径的差值大于4mm时），则该菌落的转化菌具有高效转化合成2-酮基-L-古龙酸的潜力。该菌落再经进一步摇瓶筛选，即可获得古龙酸产生菌的优良株。

本发明具有如下优点：

1.本发明基于伴生菌培养液对转化菌生长和转化的促进作用及转化产物2-酮基-L-古龙酸可引起菌落周围pH降低的原理，以伴生菌的无菌培养液作为转化菌生长和转化的激活剂，以溴百里香酚蓝为指示剂，进而得到高效、简便的优良株平板初筛方法。其筛选既避免了伴生菌的存在对转化作用的影响，又保证了伴生液对转化菌生长和产酸的激活作用，而指示剂颜色的变化又能准确指示转化菌的转化能力。

2.本发明实现了转化菌的单独培养平板筛选，和传统筛选方法比较，降低工作量50％，并大大提高筛选的准确率。

3.本发明的操作过程简单，所需试剂和材料均为实验室所常见。

4.本发明在转化菌培养过程中加入伴生菌的无菌过滤液，使转化菌在生长和产酸阶段所需伴生效应物能持续供给，促进转化菌快速生长和转化，保证了指示剂明显指示效果的获得。

5.本发明在转化菌筛选过程中，未加入伴生菌，避免了伴生菌生长对小菌及其产酸的影响，从而提高了筛选的准确性，同时极大地提高了筛选效率。

具体实施方式