[发明专利]少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

电压门控钠通道广泛分布于肌肉、神经元、腺体、心肌的可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其活动与细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等特异性功能密切相关。钠通道亚型一个引人注目的重要功能就是与伤害性感受传递、神经性疼痛的过程有关。除河豚毒素不敏感型钠通道Nav1.8和1.9是这一过程重要参与者外， Nav1.7也是其中关键因素之一。在小直径外周感觉神经元上，Nav1.7能设定Nav1.8和Nav1.9激活开放的阈值。在致炎疼痛模式动物中，发现Nav1.7表达水平被明显上调。与红斑狼疮相关的Nav1.7突变体激活被易化，与阵发性极端疼痛障碍相关的Nav1.7突变体的失活时间被延长。特别是，当Nav1.7不能产生功能时，患者会失去感受痛觉的能力，但对温觉、压觉等其它功能表现正常。因此，针对钠通道的特异阻断剂具有十分重要的镇痛药物的应用前景。

蜈蚣是一种传统中药，性温，味辛，有毒。具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛之功能。蜈蚣毒腺中含有丰富的多肽成分，目前已经证实了这些多肽成分多为神经毒素。多肽能够选择性的抑制钠通道，钾通道或是钙离子通道，因此蜈蚣毒液中的成分具有广泛的应用前途，如开发成为镇痛药物、及治疗自身免疫疾病药物。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用。

本发明提供的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，是从少棘蜈蚣粗毒中通过分子筛和反向高效液相色谱分离纯化得到，其氨基酸序列（SEQ ID NO:1）为ADNKCENSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH，该多肽包括46个氨基酸残基分子量为 5318.97，等电点为6.76，分子内含有三对二硫键排列方式为C1-C5、C2-C6和C3-C4。

少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a的基因克隆包括：

少棘蜈蚣毒腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选少棘蜈蚣钙离子通道激活剂多肽基因。扩增引物长度为17个核苷酸，其序列为5’-GCGAAAAATGGAAATCT-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3＇。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。

基因测序结果表明编码少棘蜈蚣钙离子通道激活剂的基因（SEQ ID NO:2）由426个核苷酸组成，自5’端至3’端序列基因序列包括了信号肽、前体肽和成熟肽，其中下划线部分为成熟肽。

本发明的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a在制备镇痛药物中应用。

本发明的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，对大鼠背根神经节上的钠离子通道电流有非常显著的抑制作用，是一种钠通道抑制剂；该毒素能够选择性的作用钠离子通道亚型Nav1.7，小鼠的镇痛模型表明该多肽具有良好的镇痛效果，能够在制备镇痛药物中的应用。

附图说明：

图1A至图1C为多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a的分离纯化。其中：图1A:毒素经过G50分子筛后采用C18反向HPLC分离纯化，其中箭头所示为目的峰。图1B：目的多肽进一步采用反向HPLC分离。图1C：目的分子的质谱鉴定图。

图2A至图2C为 mu-SLPTX-Ssm6a对大鼠DRG神经元的作用。其中：图2A：1μM mu-SLPTX-Ssm6a全部抑制大鼠DRG神经元上TTX-S钠电流。图2B: mu-SLPTX-Ssm6a抑制大鼠DRG神经元上TTX-S钠电流浓效曲线，其IC₅₀值为23 nM. 图2C: 1μM mu-SLPTX-Ssm6a能快速的抑制TTX-S钠电流，细胞外液也能洗脱mu-SLPTX-Ssm6a对TTX-S钠通道的抑制作用。图2D：mu-SLPTX-Ssm6a使TTX-S钠通道I-V曲线往右漂移但是不改变激活电压和反转电压。图2E: mu-SLPTX-Ssm6a使TTX-S钠通道的电导曲线往右漂移。图2F：mu-SLPTX-Ssm6a不改变TTX-S钠通道的稳态失活曲线。