[发明专利]一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用

权利要求书

1.一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白的制备方法，所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No.3665，菌种名称：枯草芽孢杆菌（Bacillussubstilis）J18，其特征是它包括以下步骤； 

J18抗菌蛋白的制备； 

种子活化：将枯草芽孢杆菌J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30℃、150-250rpm培养18h，得J18菌悬液；取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，于25℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，于30℃、150-250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150-250rpm；得活化的菌悬液； 

种子培养:将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150-250r/min，30℃摇床培养16h； 

发酵培养:使用30L发酵罐进行分批发酵；装料系数0.6(18L)，接种量5%，发酵温度30℃，通气量0.5m3/h，搅拌转速150-250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，pH 6.8~7.2，不流加调节pH值的酸碱性物质； 

发酵培养基配方为淀粉3g、蔗糖5g、硫酸锰30.8mg/kg的溶液2mL、磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾1.5g、豆粕30g，水1000mL； 

发酵周期:34±2h； 

取菌株J18发酵上清液经0.22μm孔径的细菌过滤器过滤制成无菌滤液；取无菌滤液，采用(NH4)2SO4沉淀法提取，在硫酸铵梯度40-70%下，4℃下沉淀过夜，8,000r/min离心20min，沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)悬浮，SepherdexG-25层析除盐，真空冷冻干燥，获得J18抗菌蛋白； 

所述LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和水1000mL； 

所述LB固体平板培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g和水1000mL。 

2.使用权利要求1中J18抗菌蛋白制备的蛋白制品，其特征是所述蛋白制品为被膜剂或抗菌保鲜纸。 

3.如权利要求2所述的J18抗菌蛋白制备的蛋白制品的方法，其特征是所述被膜剂的制备方法包括以下步骤： 

将J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6.0的壳聚糖溶液复配成浓度为0.05mg/mL的被膜剂，即蛋白制品。 

4.如权利要求2所述的J18抗菌蛋白制备蛋白制品的方法，其特征是所述抗菌保鲜纸的制备方法包括以下步骤： 

按照J18抗菌蛋白溶液体积与氧化淀粉溶液体积5:4的比例，取浓度为0.05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均匀，得混合液，然后用毛刷将混合液均匀涂布于保鲜纸或普通包装纸上，室温下晾干，得抗菌保鲜纸，即蛋白制品； 

所述氧化淀粉溶液的配制：称取160g可溶性淀粉，0.96g高锰酸钾，8g氢氧化钠，加入800mL水，加热至90-95℃，持续搅拌20-30min，冷却即得氧化淀粉溶液。 

5.权利要求1或2所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治果实和农作物病害中的应用。 

6.权利要求1所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治梨轮纹病、葡萄灰霉病和黄瓜镰刀霉中的应用。 

7.权利要求1所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治梨采后黑斑病的应用。