[发明专利]一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因降解中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种羧酸酯酶D-1CarE3及其在农药马拉硫磷和西维因降解中的应用。

背景技术

    羧酸酯酶（Carboxylesterases, E C3.1.1.1）是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三联体结构，Ser，Asp，His构成了羧酸脂酶的催化活性中心（Nardini, M, et al., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9(6):732-737.）。

羧酸脂酶广泛存在于动物、植物、微生物中(Melloney J., et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.)，其中微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等上有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos Tombo, et al., Agricultural and Biological Chemistry. 1987, 51:1833-1838.）。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景（Jaeger K.E., et al., Trends in Biotechnology. 1998, 16(9):396-403.）。

当前农业生产中，70%使用的农药是有机磷农药，而70%的有机磷农药又是高毒农药，这些农药的使用很容易在农产品中残留，进而影响到人的健康。本文研究的羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，其对含有羧酸酯键的有机磷化合物，如马拉硫磷，羧酸酯酶靠活性中心丝氨酸的可逆酰化作用来完成降解。这个酰化作用释放出一个醇部分和一个对应的共价酰化酶。这个酰化的中间体由于水的亲核作用释放出对应的羧酸部分和有活性的酶，它可以重新来催化新一轮的降解反应。

利用微生物降解农药残留大多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高羧酸酯酶的表达量，实现其大规模工业化生产。本文从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组中克隆羧酸脂酶基因D-1CarE3与表达载体pET28a(+)连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对羧酸酯酶酶学性质及羧酸酯酶对农药马拉硫磷和西维因的降解活性进行了初步研究，为进一步探索羧酸酯酶的应用奠定了理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种羧酸酯酶D-1CarE3。

本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因D-1CarE3。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的最后一个目的是提供上述羧酸酯酶D-1CarE3在马拉硫磷和西维因的降解中的应用。

本发明所述羧酸酯酶D-1CarE3可得自嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）。D-1CarE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的羧酸酯酶D-1CarE3总共含有513个氨基酸，理论分子量为56.01 kDa，理论等电点为5.69。以β-乙酸萘酯为底物：该酶作用的最适温度65 ℃；最适pH7.0；终浓度1 mM的金属离子K⁺和Pb²⁺对酶有激活作用，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺和Mn²⁺等有抑制作用； 在温度37 ℃保温50 min，仍能保持70%以上的活性；经1/15 mol/L pH7.0缓冲液下处理50 min，仍能保持50%以上的活性；酶液在室温（23 ℃）放置5 d，仍有27%以上的活性。

本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因D-1CarE3，该基因序列如SEQ ID NO.2。