[发明专利]利用免疫层叠法进行可溶性靶物质的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学实验技术领域，具体是指一种利用免疫层叠法进行可溶性靶物质检测的方法。 

背景技术

免疫学技术是一类用于生物学及医学领域实验研究，临床诊断，及其相关生物制品生产监测的实验方法。该类方法大致分为均相与固相免疫技术两类。其发展顺序可界定为传统均相与类均相免疫，固相免疫，及其现代均相与类均相免疫等三个主要阶段。各阶段发展过程相互交错，相互推进，相互补充，从而构成一套完整地免疫血清学实验技术体系。新近，传统均相免疫实验因其敏感性及其操作上的诸多原因已较少在临床（及田间）使用；现代均相免疫实验因其技术含量过高，以及自身技术缺陷等原因尚未得以普及；而固相免疫实验则成为迄今应用最广泛的实验技术。 

标记免疫学技术创建于上世纪六十年代中后期，它同时用于固相及均相免疫技术中，是免疫（血清）学实验的一个重大技术进步。既往标记固相免疫实验就其反应方式而言包括直接法、间接法、补体法、双抗体（或双抗原）夹心法、几种不同方式的竞争与竞争抑制法，液相PAP技术，以及多种蛋白芯片技术等试验形式，具有高度的特异性、敏感性与稳定性。操作步骤繁琐及其定量检测范围狭窄是该类方法的主要缺点。自动化仪器的发展及其推广应用使操作繁琐的缺点从表观上得以纠正或部分纠正，但其对实验结果稳定性的影响并未因此而根除。现代均相（及类均相）免疫技术的研发能有效地克服固相免疫检测操作繁琐的弊端，并能保持与之相同或更高的特异性，稳定性与敏感性，如能克服定量范围狭窄及其Hooks效应干扰等技术瓶颈，将具有极其广阔地应用前景。 

现代均相免疫实验（包括LiCA等类均相免疫试验）是一类为简化固相免疫实验操作步骤而发展起来的新的试验方法。具备与固相免疫实验相当或更高的 敏感性，特异性与稳定性。实验步骤较固相免疫实验显著简单。其定量检测范围与部分发光免疫检测技术相当（如电化学发光），但仍远不足以对多数免疫物质作全定量检测。Hooks效应对其试验结果的影响较固相法相当或略重，且几种在固相免疫检测方法中纠正Hooks效应的反应模式，如二步法，一道洗涤法，及其排溢法等均无法用于均相免疫技术。这类技术缺陷严重妨碍了均相免疫技术的推广应用。如能克服这类弊端，其使用价值可望显著大于现行固相免疫检测。 

传统均相与类均相免疫检测技术操作相对简便，可同时进行初步的定性与定量（或半定量）检测。该类方法敏感性偏低，定量范围偏向靶物质含量的高浓度端，受Hooks效应影响程度相对较小等特征既是该类方法的技术缺陷，亦是它们区别于前两类方法的重要特征。近十余年来，由于在材料与方法学上的进步，上述缺陷已部分纠正。 

“Hooks效应”或称“钩状现象”是一种存在于多种血清学检测中的量（靶物质浓度）效（检测信号）分离现象，其发生虽可能与靶物质免疫分子的结构相关，但反应体系中靶抗原与对应抗体比例的高度失调是其最主要的原因。其表现为当反应体系中靶物质，包括抗原或抗体的浓度升高到一定程度后，检测信号反而下降或显著下降，甚至出现假阴性结果。随着标记免疫学技术在敏感性上的大幅提升，尤其是当部分固相免疫实验主要反应方式由传统的二步法转变为一步法（如一步法ELISA），并在我国临床检验中大量普及应用后，由Hooks效应引起的检验结果失真便成为一个较为常见的临床现象。这一效应直接造成检测结果的失真，显著妨碍科研数据的准确性，并对临床诊断、治疗及其预后的判断造成负面影响。如果发生于某些特殊临床检测如采用一步法ELISA或化学发光技术进行血清HBsAg筛选，则可造成大量临床标本的定量结果偏离真值，部分强阳性标本测值降低或显著降低，甚至导致个别具有高度传染性的强阳性标本出现假阴性结果。如果这种漏检发生在献血员筛选，则势必导致输血相关性肝炎的严重临床事件。在我国，血清HBsAg检测的类均相免疫检测实验如光激发化学发光实验（Light Initiated chemilumiNescence assay.LiCA）方法及其试剂已获准进入临床应用，其实验结果受Hooks效应的影响与一步法ELISA等方法相当或更甚，若将其误用于HBsAg的献血员筛选，亦有可能产生与其它 一步法固相免疫检测相似的负面效果。鉴于血清HBsAg检测的规模及其社会影响面极大，一些存在Hooks效应干扰的检测方法（如“一步法”ELISA与“一步法”化学发光等）已在我国献血员HBV感染筛选中被禁止使用。LiCA也在禁用之列。