[发明专利]海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种从海洋菌发酵产物中提取有效成份的方法，特别是一种海洋多粘类芽孢杆菌L₁-9发酵产物提取DEHP的方法，本发明还涉及前述DEHP的用途。

背景技术

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）作为重要的植物病害生防细菌和植物根际促生菌在农业领域已得到广泛应用。多粘类芽孢杆菌能产生肽类、蛋白质类、核苷类、吡嗪类和酚类等多种抗菌物质，如多粘类芽孢杆菌VLB16所产生的蛋白能够抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的生长，其分子量为37KDa，并且能耐121℃的高温。Beatty等从多粘类芽孢杆菌PKB1菌株的细胞中分离到一簇分子量大小分别为883、897、948 和916 D的抗菌多肽，陈海英等从多粘类芽孢杆菌CP7代谢产物中分离到3种抗革兰氏阴性菌的小分子多肽，其中组分C1为多粘菌素E1，范磊等从多粘类芽孢杆菌HY96-2发酵液中分离到一个抗真菌活性化合物6B，经光谱学方法鉴定为Fusaricidin A，该化合物对西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）等多种植物病原真菌均具有较好的抑制作用。

已有研究的多粘类芽孢杆菌主要分离自土壤，少数为植物内生菌，均为陆生环境，未见有关来自海洋的多粘类芽孢杆菌的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提取方法简便合理、可操作性强、产物纯度高的海洋多粘类芽孢杆菌L₁-9发酵产物提取DEHP的方法。

本发明所要解决的另一技术问题是提供上述方法得到的DEHP的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，其特点是，其步骤如下：

（1） L₁-9菌株发酵液的制备：用发酵罐对L₁-9菌株进行分批发酵，发酵条件为：种子液的菌龄24h、浓度为10⁹个细胞/mL，接种量8%，温度28℃，pH 6.3，初始搅拌速度250r/min，通气量3L/min，发酵时间36h；得L₁-9菌株发酵液；L₁-9菌株发酵液经10000r/min离心后，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的L₁-9菌株发酵液进行初步提取；

（2）抗菌活性物质的初步提取：L₁-9菌株发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次，静置12h后，合并有机相，减压浓缩后得到红褐色油状粗提物，以50μl/孔粗提物对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的粗提物进行分离纯化；

（3）抗菌活性物质的分离纯化：

a. 硅胶柱层析：粗提物采用2.5×60cm硅胶柱进行初步分离，装柱体积为200mL，湿法上样，以体积比为100~80：0~20的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，每种比例洗脱液体积400mL，流速0.5mL/min，每管收集10mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液进行Sephadex LH-20柱层析；

b．Sephadex LH-20柱层析：洗脱液用1.5×50cm的Sephadex LH-20柱进行层析分离，湿法上样，以体积比为3:2的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL/h，每管收集2-3mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液经TLC检测有3个斑点，3个斑点迁移率分别为0.47、0.66、0.91，再采用制备薄层层析进一步分离纯化；