[发明专利]一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法

权利要求书

1.一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于：所述生物催化剂为重组酮还原酶，该酮还原酶的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35~40℃下振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.6~0.8时，加入诱导剂，于25~33℃下继续培养8~12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8~12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10℃~-25℃，然后再冻干24~48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶；所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7.0~9.0的水相缓冲液和甲苯的混合体系中进行，其中，水相缓冲液与甲苯的体积比为4~20:1。

2.根据权利要求1所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为10%~40% (w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的0.5%~2.0% (w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的1.05~1.2倍，辅因子的用量为底物质量的0.02%~0.1% (w/w)。

3.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，底物的浓度为31%~40% (w/v)。

4.根据权利要求1或2或3所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

5.根据权利要求1或2或3所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。

6.根据权利要求1或2或3所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为磷酸氢盐、磷酸二氢盐和水配制而成的磷酸盐缓冲液，磷酸氢盐与磷酸二氢盐的总浓度为10~200 mM；或者，所述的水相缓冲液为Tri-HCl缓冲液。

7.根据权利要求1所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述水相缓冲液与甲苯的体积比为4~10:1。

8.根据权利要求7所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述水相缓冲液与甲苯的体积比为4~6:1。

9.根据权利要求1或2或3或6所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：所述制备方法的实施过程如下：在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液或形成所述水相缓冲液所需要的成分，然后依次加入甲苯、异丙醇、底物、重组酮还原酶以及辅因子，于温度25℃~45℃下搅拌反应，利用HPLC-MS方法或气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到80%~100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品。

10.根据权利要求9所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于：至转化率大于99%时，方加入乙酸乙酯进行萃取。