[发明专利]PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法。

背景技术

家蚕微粒子虫(Nosema bombycis Naegeli 1857)是家蚕微粒子病的病原。家蚕微粒子虫是一种原生动物，当其在家蚕体内寄生时，以孢子形态出现最多，孢子为单细胞构造，通常为椭圆形，外包裹0.5微米厚的孢子壁，孢子壁很坚韧，能耐弱酸和碱，对外界的抵抗力很强。家蚕微粒子病是一种全身性感染的慢性蚕病，病程较长，且在家蚕的各个发育阶段都有不同的病征和病变，是毁灭性蚕病之一，被世界各养蚕国家确定为强制检疫对象。

1865～1970年，法国科学家巴斯德(Louis Pasteur)对家蚕微粒子病害进行了一系列的研究，发现微粒子原虫是该病害的病原，并可通过食下和胚种两个途径感染家蚕。巴斯德建立了母蛾单蛾光学显微镜检疫的技术方法，但随着蚕种生产量的扩大，检疫工作量大幅上升，单蛾光学显微镜检疫技术无法适应生产需求。

上世纪60年代，日本科学家建立了母蛾集团光学显微镜检疫技术，我国在80年代的主要蚕区开始推广应用至今。母蛾集团检疫在一定程度上节省了检疫时间和成本，但仍存在一些问题，其一是母蛾检疫是一种产品的间接检疫，在检疫结果与产品的对应性上存在明显缺陷；其二是光学显微镜在鉴别不同种类微孢子虫或类似物时的能力十分有限。

分子生物学技术的高速发展，为家蚕微粒子虫的检测提供了新的技术方法和手段，也使直接针对蚕卵进行检疫成为了可能，科学家针对免疫学检测技术和PCR检测技术在家蚕微粒子虫检测中的应用进行了广泛研究。

现有免疫学技术特别是酶标技术和胶体金技术在技术上具备良好的商业化平台，但由于家蚕微粒子虫的大个体和高比重等特性，使其检测的稳定性和灵敏度等方面存在缺陷，难于在生产上应用。

PCR检测技术在家蚕微粒子虫的检测中可以避免免疫学技术所存在的上述问题，操作也较为容易，成本相对较低，但在实际应用过程中还存在着一定的缺陷。一般在PCR检测过程中，都需要先提取待测样本的核苷酸，而该过程因耗时较长，不适合生产中大批量样本的检测；通过对样本进行煮沸的处理后直接进行LAMP技术，节省了核苷酸提取过程，简单易行，但其过高的假阳性，特异性不佳，因而其只能应用于一般性病原虫检查而无法应用于检疫性病原虫；荧光定量PCR方法虽然具有很好的特异性和批量检测的优点，但仍然避免不了核苷酸的制备过程，检疫成本相对较高。

发明内容

本发明提供了一种蚕卵样本的处理方法，解决了现有PCR法检测家蚕微粒子虫需提取蚕卵样本的核苷酸，耗时较长的问题。

一种蚕卵样本的处理方法，包括：将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液pH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含1～10mol/L的甜菜碱。

所述蚕卵样本可以是即时浸酸的蚕卵、或冷藏浸酸后的蚕卵、多化性蚕卵或自然越年蚕卵。

碱性环境可以诱导家蚕微粒子虫孢子发芽，弹出极丝，释放孢原质及核酸，但强碱性环境不利于PCR的进行，因此需要将溶液pH值调节至中性；另外，加入甜菜碱可以一定程度上消除蚕卵成分会对PCR反应造成的干扰，优选的，甜菜碱的浓度为5～8mol/L，最优选的，甜菜碱的浓度为5mol/L。

优选的，所述前处理液包含0.5～2mol/L的NaOH。由于蚕卵具有坚硬的外壳，家蚕微粒子虫的孢子也有坚硬的孢子壁，两者都不易破裂，氢氧化钠可以软化和崩解蚕卵外壳，更优选的，所述NaOH的浓度为1mol/L。

蚕卵在前处理液中的放置时间影响蚕卵的崩解率、微粒子虫孢子的发芽率以及释放核酸的量，所述放置时间优选为30～120min，在这个时间范围内，PCR结果差异不大。

本发明还提供了一种检测蚕卵中家蚕微粒子虫的方法，包括：

(1)取蚕卵样本，利用所述的处理方法对蚕卵样本进行处理，获得PCR模板；

(2)设计特异性引物，利用步骤(1)获得的PCR模板进行PCR扩增；

(3)将PCR扩增产物电泳分离，染色成像，根据成像结果判定蚕卵样本中是否含有家蚕微粒子虫。

扩增参数的选择也有可能影响最终的检测结果，本发明PCR扩增的参数优选为：预变性95℃，5min；变性95℃，0.5min，退火48.3℃，0.5min，延伸72℃，1min，循环35次；延伸72℃，5min。

本发明又提供一组检测家蚕微粒子虫的特异性引物，具体为：