[发明专利]一种制备大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞

说明书

技术领域

本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及一种制备大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。 

背景技术

鱼类是具有细胞免疫和体液免疫系统的最低等的脊椎动物，免疫球蛋白是机体免疫应答反应的最主要介质。当鱼体受到外来物质刺激后（如病害、疫苗等），其体内会产生相应的免疫球蛋白。据此，通过对特异性免疫球蛋白的检测，不仅可以早期诊断疾病，对疾病做出预警，也可以实时检测动物接种疫苗后体内抗体的应答反应，为有效的免疫程序制定提供保证。 

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我国引进的海水养殖名贵鱼种，因其生长快、肉质鲜嫩等优点，已成为我国北方工厂化养殖的主要种类。然而随着其养殖规模的迅速扩大，养殖密度的不断增加，疾病问题日渐突出。在越来越高的环保和食品健康安全的要求下，以疫苗等为主要代表的新型病害防治手段得到广泛发展。因此，对大菱鲆免疫球蛋白及其抗体的研究在疾病早期检测和疫苗的开发应用中具有重要意义。 

目前，有关大菱鲆免疫球蛋白及其抗体的研究报道非常有限。相关大菱鲆免疫球蛋白的纯化方法只见一篇报道（魏鉴腾等，2008），其纯化方法相对繁琐，且其纯化的目的是制备多克隆抗体（多抗），而非单克隆抗体（单抗）。而单抗制备对免疫球蛋白纯度要求更高，且单抗能更精准的捕获微量的免疫球蛋白，提高检测的灵敏度和准确性，以此来提升大菱鲆病害防治水平，具有重要的理论和现实意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种制备大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，即一种能够高效稳定表达大菱鲆免疫球蛋白的杂交瘤细胞，其制备的单抗运用于大菱鲆的病原早期诊断和免疫应答规律的研究。 

本发明的杂交瘤细胞株T-IgM-H，已于2012年10月24日保藏于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2012129。 

本发明的杂交瘤细胞的制备方法包括有大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化、杂交瘤细胞的制备和筛选步骤，其特征在于，所述的分离纯化是采用盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白进行粗提获得粗体液，再将粗提液透析后过 Sephadex-200凝胶柱得到大菱鲆血清免疫球蛋白。 

上述的Sephadex-200凝胶柱的规格为80 cm × 1.5 cm。 

上述的杂交瘤细胞的制备步骤是将纯化的大菱鲆血清免疫球蛋白免疫BALB/C小鼠后获得杂交瘤细胞。 

本发明的杂交瘤细胞可以稳定高效的制备大菱鲆免疫球蛋白的单克隆抗体，制备出的单抗建立间接酶联免疫吸附实验方法，能够检测多种病原的特异性免疫球蛋白，达到病原早期诊断的目的。并且能够对多种疫苗免疫效果进行评估，为正确的免疫程序制定提供数据支持。 

附图说明

图1：大菱鲆免疫球蛋白SDS-PAGE和Western-blot图。 

其中箭头所示位置为免疫球蛋白的重链(上端)和轻链(下端)，M-marker、 

1、大菱鲆免疫球蛋白SDS-PAGE ；2、大菱鲆免疫球蛋白western-blot分析 

图2： 间接酶联免疫吸附法检测健康大菱鲆、患鳗弧菌病大菱鲆和经鳗弧菌疫苗免疫的大菱鲆血清特异性抗体水平。 

具体实施方式

一、大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化 

正常大菱鲆尾静脉采血，室温放置1 h后，4℃过夜，次日离心(5000 r/min，30 min，4℃)分离血清，分装并保存于－70℃冰箱待用。 

盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白进行粗提，将大菱鲆血清以等体积0.01 mol/L(pH=7.4)磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后，在0.01 mol/L(pH=5.4)磷酸缓冲液(PB)中4℃透析，离心(3000 r/min，30 min，4℃)收集沉淀后，将沉淀溶解于0.1 mol/L(pH=5.4)PB中后继续按上述方法透析，再次离心收集沉淀后并将其溶解于0.1 mol/L(pH=8.6)PB中，过Sephadex-200凝胶柱(80 cm × 1.5 cm)进一步纯化，以0.1 mol/L(pH=8.6)PB为洗脱缓冲液，十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验，收集纯度高的样品。结果显示，应用该方法所分析得到的免疫球蛋白有2条带,分子量分别是76 kD和27 kD，代表免疫球蛋白的重链和轻链(图1)，结果与文献报道一致；而且该纯化方法简便、易于操作。 

二、大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备